用于测定抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的方法技术

本发明专利技术公开了用于测定抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的方法，本发明专利技术构建了稳定表达CD32a‑FcεRIγ融合蛋白受体和由NFAT应答元件驱动表达的荧光素酶的效应细胞Jurkat/NFAT/CD32a‑FcεRIγ，将Raji细胞用作靶细胞，用于抗体药物ADCP生物学活性的检测，该方法无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分，操作简单，试验周期短，检测结果稳定可靠，专属性强，准确度高，可用于单克隆抗体产品的批次放行、稳定性检测和生物类似药的比较中，具有很好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
用于测定抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的方法
本专利技术属于生物医药
，具体地，涉及一种用于测定抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的方法。
技术介绍
靶向肿瘤相关抗原的治疗性抗体可以通过不同的途径来杀伤肿瘤细胞，主要的机制包括：(1)抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(Antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)；(2)补体依赖的细胞毒作用(Complement-dependentcytotoxicity，CDC)；(3)抗体依赖性细胞吞噬作用(Antibodydependentcellularphagocytosis，ADCP)；(4)抗体直接诱导细胞凋亡。其中，ADCC的作用机制是抗体的Fab(Fragmentantigen-bindingregion)段结合肿瘤细胞的抗原表位，其Fc(Fragmentcrystallizableregion)段与杀伤细胞如NK细胞、巨噬细胞等表面的Fc受体(Fcreceptor，FcR)结合，介导杀伤肿瘤细胞，活化的NK细胞能够释放本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n(1)构建pGL4[NFAT/puro]质粒和pcDNA3.1(+)[CD32a-FcεRIγ/G418]质粒；/n(2)将步骤(1)中所述的质粒转染到Jurkat细胞中；/n(3)使用嘌呤霉素和G418进行筛选获得混合克隆细胞株，进一步通过有限稀释法筛选获得单克隆细胞株；/n(4)通过预实验以及流式细胞仪筛选得到阳性克隆细胞株；/n优选地，步骤(2)中所述转染的方式为电穿孔转染法；/n优选地，步骤(3)中所述的嘌呤霉素和G418的浓度分别为1μg/mL、400...

【技术特征摘要】
1.一种稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)构建pGL4[NFAT/puro]质粒和pcDNA3.1(+)[CD32a-FcεRIγ/G418]质粒；
(2)将步骤(1)中所述的质粒转染到Jurkat细胞中；
(3)使用嘌呤霉素和G418进行筛选获得混合克隆细胞株，进一步通过有限稀释法筛选获得单克隆细胞株；
(4)通过预实验以及流式细胞仪筛选得到阳性克隆细胞株；
优选地，步骤(2)中所述转染的方式为电穿孔转染法；
优选地，步骤(3)中所述的嘌呤霉素和G418的浓度分别为1μg/mL、400μg/mL。


2.一种稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞，其特征在于，所述细胞由权利要求1所述的构建方法构建得到的。


3.一种融合蛋白受体，其特征在于，所述融合蛋白受体为CD32a-FcεRIγ；
优选地，所述融合蛋白受体的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；
更优选地，所述融合蛋白受体的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。


4.一种抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)构建稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat效应细胞；
(2)将抗CD20单克隆抗体药物样品和参比品预稀释到一定的初始工作浓度，再进行等比例稀释；
(3)将步骤(2)中稀释后的抗CD20单克隆抗体药物样品和参比品加入到一定比例的靶细胞和效应细胞中，进行孵育；
(4)加入荧光底物，根据测定的化学发光值拟合四参数曲线确定抗体药物的ADCP生物学活性；
优选地，步骤(4)中所述的四参数曲线是在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值，通过数据处理拟合得到的四参数曲线；
更优选地，通过比较参比品与样品四参数曲线的半数有效浓度EC50值，得出样品的相对生物学效价。


5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat效应细胞采用权利要求1所述的构建方法构建得到的；
优选地，所述步骤(2)中抗CD20单克隆抗体药物样品和参比品的初始工作浓度为5×103ng/mL，等比例稀释的比例为1:4。


6.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中的靶细胞为表达CD20的细胞；
优选地，所述靶细胞包括Raji细胞、WIL2-S细胞、SU-DHL-10细胞、DOHH2细胞、BJAB细胞、A20细胞、SU-DHL-4细胞、P30/OHK细胞、P116细胞、MUTZ-3细胞、SUPB15细胞、SNK6细胞、SK-MEL-28细胞、C8161细胞、RPMI-7951细胞；
更优选地，所述靶细胞为Raji细胞；
优选地，所述步骤(3)中的靶细胞和效应细胞的比例为1:1-10；
更优选地，所述步骤(3)中的靶细胞和效应细胞的比例为1:8；
最优选地，每孔靶细胞数量为1×104个。


7.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中孵育的时间为3-20h；
优选地，所述步骤(3)中孵育的时间为6h；
优选地，所述步骤(3)中孵育的条件为37℃、5％CO2培养箱中孵育。


8.一种抗CD20单克隆抗体药物ADCP生物学活性的评价体系，其特征在于，所述评价体系包括如下组分：抗CD20单克隆抗体药物样品、参比品、稳定表达CD32a-FcεRIγ和NFAT-Luc报告基因的Jurkat效应细胞、...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兰，刘春雨，于传飞，杨雅岚，段茂芹，俞小娟，崔永霏，徐苗，王军志，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11