一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法技术

本发明专利技术公开一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，涉及石斛氨基酸测定技术领域，是基于现有的石斛中游离氨基酸含量的测定方法，常见氨基酸种类测定不全、含量测定误差较大、需要标准品多、试验成本高、工作量大等问题提出的。本发明专利技术采用柱前衍生化技术，向氨基酸分子中引入较强紫外吸收的异硫氰酸苯酯(FITC)，从紫外吸收角度，提高各氨基酸的相似性，在此基础上，构建基于FITC‑柱前衍生化HPLC‑DAD分析技术的、采用一测多评法可同时测定石斛中20种游离氨基酸含量的方法；本发明专利技术方法可显著提高一测多评的准确度，且操作简单，只需要对一种氨基酸进行柱前衍生化处理、节约成本。

【技术实现步骤摘要】
一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法
本专利技术涉及石斛氨基酸测定
，更具体地说，关于一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法。
技术介绍
石斛为兰科石斛属多基源中药。自《神农本草经》首载石斛入药以来，《本草经集注》、《本草图经》、《本草衍义》等历代本草记载均以“石斛”为名。《本草纲目》集前人论述，首次记载金钗石斛，《本草纲目拾遗》首次记载了霍山石斛。近代中草药书籍，包括《中国药典》、《全国中草药汇编》、《中药志》、《中华本草》等，以及各类教科书、期刊，有关石斛记载也均以“石斛”为正名。迄今为止已发现石斛属植物1100种，其中我国有76种，包括霍山石斛、铁皮石斛、马鞭石斛、金钗石斛、流苏石斛等。2020版中国药典，规定中药石斛为“金钗石斛、霍山石斛、鼓槌石斛或流苏石斛及其近似种的新鲜或干燥茎”，这些石斛属植物作为中药石斛入药，具“益胃生津、滋阴清热”，主治“热病津伤，胃阴不足，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热等”，用量为“干品12-15克或鲜品15-30克”。在药材市场上，石斛多以鲜品加工炮制成干品形式销售及临床应用。传统的石斛炮制方法包括：修制、炒制、清洗、绕条、加箍、烘焙、整形等工序。游离氨基酸指游离状态存在的氨基酸，在植物种广泛存在，是重要的生物活性分子之一，是构建细胞和组织的基础物质。在加热的情况下，游离氨基酸和糖类会发生美拉德反应，产生大量中间产物和终产物，这些产物具有多种生活性，是中药药效物质和食品风味的重要来源，少数美拉德反应产物对人体有害。作为美拉德反应的重要底物，游离氨基酸的种类与含量直接影响美拉德反应产物的种类，进而影响中药药效和食品的风味。石斛鲜条干制过程中，炒制、烘焙等加热工序，会有大量美拉德反应发生，石斛鲜条中游离氨基酸的种类与含量直接影响石斛炒制、烘焙过程中的美拉德反应产物，影响石斛的药效、品质和口感。构建一个可同时测定多种游离氨基酸的高效、经济的方法，对于石斛及其加工炮制过程中的质量控制具有重要意义。目前对于氨基酸含量测定的方法主要有：(1)氨基酸自动分析仪测定，如文献《安徽霍山三种石斛中游离氨基酸分析》([J].安徽农业大学，1995(3):268-269.)，采用氨基酸自动分析仪测定安徽霍山三种石斛中游离氨基酸的含量。但是，氨基酸自动分析仪测定游离氨基酸局限性在于：测定时间相对较长；采用水合茚三酮柱后衍生化，造成柱后扩散比较大，峰形变宽，分辨率降低；难以检测天冬酰胺胺、谷氨酰胺、色氨酸。(2)HPLC法直接测定，通过标准品建立不同氨基酸标准曲线方程，通过测定样品中不同氨基酸的峰面积，计算样品中氨基酸含量。但是，HPLC法直接测定游离氨基酸含量局限性在于：很难选择一个合适的波长使得20种氨基酸都有较高摩尔消光系数，导致同时测定多种氨基酸时，部分氨基酸定量限、灵敏度较差；需要多种氨基酸标准品。文献《柱前衍生-HPLC法测定不同产地流苏16种游离氨基酸含量及其聚类分析》([J].现代中药研究与实践，2020(3):4-8.)，采用柱前衍生化-HPLC建立流苏石斛中16种游离氨基酸的含量测定方法，通过R语言聚类热图、SPSS聚类分析对不同产地流苏石斛进行聚类分析。但是技术存在的问题如下：只能测定16种游离氨基酸的含量，并需要对16种氨基酸分别进行柱前衍生化处理，原料和试验成本大，工作量大，操作复杂。中药与食品质量控制中，需要对多种成分的含量进行定性定量分析，当标准品缺乏时，常规方法难以完成对无标准品组分的定量分析，一测多评法可解决在无标准品时如何对多个组分定量分析问题，然而，其定量分析的准确度，受参与一测多评的多个化合物间结构相似性影响。当化合物结构差异较大时，一测多评用于定量分析，准确度低，成为一测多评法应用的难题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于解决现有的石斛中游离氨基酸含量的测定方法，常见氨基酸种类测定不全、含量测定误差较大、需要标准品多、试验成本高、工作量大等问题。本专利技术通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，包括以下步骤：(1)将新采集的石斛鲜条洗净后进行脱水处理至恒重，粉碎、过40目筛，获石斛干粉；称取石斛干粉置于烧瓶中，向烧瓶中加入提取剂，在60℃下进行超声提取，然后重复离心提取三次，将三次离心的上清液合并，再置于60℃下减压浓缩至干，向减压浓缩得到的残渣加入0.1mol/L的HCl溶解后转移至10mL具塞试管中，再使用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，混匀，得到供试品储备液；(2)柱前衍生化方法制备供试品溶液移取2.0mL步骤(1)制得的供试品储备液于10.0mL具塞试管中，向具塞试管中加入14％三乙胺-乙睛溶液和1.2％异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯(FITC)-乙睛溶液各1.0mL，混匀，室温避光静置30min，加入4.0mL正己烷，涡旋混合器振荡60s，静置10min，吸取下层溶液，即可得供试品溶液；(3)构建HPLC色谱条件流动相A为0.1mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为乙腈-水；梯度洗脱条件为：0-3min、0％B；3-15min、0-12％B；15-20min、12-15％B；20-35min、15-25％B；35-40min、25-35％B；40-50min、35-65％B；柱温为35℃；流速为1.0mL/min；检测波长为254nm；(4)吸取步骤(2)中制得的供试品溶液，采用高效液相色谱仪器并按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，以20种常见氨基酸中任意一种氨基酸为内标物，通过计算内标物氨基酸与其它氨基酸在HPLC图上的相对距离ΔtRis，确定供试品溶液HPLC图谱中氨基酸的色谱峰，计算各氨基酸峰面积，通过内标物氨基酸与其它氨基酸的ΔtRis值，鉴定HPLC图谱上的色谱峰所对应的氨基酸，并确定供试品溶液中内标物氨基酸具体为哪一种氨基酸，再根据内标物氨基酸与其他待测氨基酸的峰面积之比，计算出内标物氨基酸对待测氨基酸的换算因子fs/i；ΔtRis计算方法如下：ΔtRis＝tRi-tRs式中，tRi为测定的待测氨基酸在HPLC图谱上保留时间，tRs为测定的内标物氨基酸在HPLC图谱上保留时间；(5)取步骤(4)中鉴定出的内标物氨基酸为对照氨基酸，将对照氨基酸用0.1mol/L盐酸溶于10.0mL容量瓶中，均匀混合，定容，得对照品储备液，然后按照步骤(2)的操作将对照品储备液进行柱前衍生化处理，得到对照品溶液；(6)游离氨基酸含量测定将得到的对照品溶液等比稀释成10个梯度，然后按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，获得内标物氨基酸标准曲线；将步骤(4)中计算出的供试品溶液中该内标物氨基酸峰面积代入曲线方程，计算出供试品溶液中该内标物氨基酸的浓度，然后按以下公式计算出供试品溶液中其它氨基酸的浓度：Ci＝(Cs/As)×fs/i×Ai式中，As为供试品溶液中内标物氨基酸的峰面积，Cs为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将新采集的石斛鲜条洗净后进行脱水处理至恒重，粉碎、过40目筛，获石斛干粉；称取石斛干粉置于烧瓶中，向烧瓶中加入提取剂，在60℃下进行超声提取，然后重复离心提取三次，将三次离心的上清液合并，再置于60℃下减压浓缩至干，向减压浓缩得到的残渣加入0.1mol/L的HCl溶解后转移至10mL具塞试管中，再使用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，混匀，得到供试品储备液；/n(2)柱前衍生化方法制备供试品溶液/n移取2.0mL步骤(1)制得的供试品储备液于10.0mL具塞试管中，向具塞试管中加入14％三乙胺-乙睛溶液和1.2％异硫氰酸苯酯-乙睛溶液各1.0mL，混匀，室温避光静置30min，加入4.0mL正己烷，涡旋混合器振荡60s，静置10min，吸取下层溶液，即可得供试品溶液；/n(3)构建HPLC色谱条件/n流动相A为0.1mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为乙腈-水；/n梯度洗脱条件为：0-3min、0％B；3-15min、0-12％B；15-20min、12-15％B；20-35min、15-25％B；35-40min、25-35％B；40-50min、35-65％B；/n柱温为35℃；/n流速为1.0mL/min；/n检测波长为254nm；/n(4)吸取步骤(2)中制得的供试品溶液，采用高效液相色谱仪器并按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，以20种常见氨基酸中任意一种氨基酸为内标物，通过计算内标物氨基酸与其它氨基酸在HPLC图上的相对距离Δt...

【技术特征摘要】
1.一种采用一测多评法测定石斛中游离氨基酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将新采集的石斛鲜条洗净后进行脱水处理至恒重，粉碎、过40目筛，获石斛干粉；称取石斛干粉置于烧瓶中，向烧瓶中加入提取剂，在60℃下进行超声提取，然后重复离心提取三次，将三次离心的上清液合并，再置于60℃下减压浓缩至干，向减压浓缩得到的残渣加入0.1mol/L的HCl溶解后转移至10mL具塞试管中，再使用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，混匀，得到供试品储备液；
(2)柱前衍生化方法制备供试品溶液
移取2.0mL步骤(1)制得的供试品储备液于10.0mL具塞试管中，向具塞试管中加入14％三乙胺-乙睛溶液和1.2％异硫氰酸苯酯-乙睛溶液各1.0mL，混匀，室温避光静置30min，加入4.0mL正己烷，涡旋混合器振荡60s，静置10min，吸取下层溶液，即可得供试品溶液；
(3)构建HPLC色谱条件
流动相A为0.1mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为乙腈-水；
梯度洗脱条件为：0-3min、0％B；3-15min、0-12％B；15-20min、12-15％B；20-35min、15-25％B；35-40min、25-35％B；40-50min、35-65％B；
柱温为35℃；
流速为1.0mL/min；
检测波长为254nm；
(4)吸取步骤(2)中制得的供试品溶液，采用高效液相色谱仪器并按照步骤(3)构建的HPLC色谱条件进行色谱分析，以20种常见氨基酸中任意一种氨基酸为内标物，通过计算内标物氨基酸与其它氨基酸在HPLC图上的相对距离ΔtRis，确定供试品溶液HPLC图谱中氨基酸的色谱峰，计算各氨基酸峰面积，通过内标物氨基酸与其它氨基酸的ΔtRis值，鉴定HPLC图谱上的色谱峰所对应的氨基酸，并确定供试品溶液中内标物氨基酸具体为哪一种氨基酸，再根据内标物氨基酸与其他待测氨基酸的峰面积之比，计算出内标物氨基酸对待测氨基酸的换算因子fs/i；
ΔtRis计算方法如下：
ΔtRis＝tRi-tRs
式中，tRi为测定的待测氨基酸在HPLC图谱上保留时间，tRs为测定的内标物氨基酸在HPLC图谱上保留时间；
(5)取步骤(4)中鉴定出的内标物氨基酸为对照氨基酸，将对照氨基酸用0.1mol/L盐酸溶于10.0mL容量瓶中，均匀混合，定容，得对照品储备液，然后按照步骤(2)的操作将对照品储备液进行柱前衍生化处理，得到对照品溶液；
(6)游离氨基酸含量测定
将得到的对照品溶液等比稀释成10个梯度，然后按照步骤(3)构建的HP...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈乃东，王宇，王荣花，石玉堃，郝经文，刘孝全，李强，朱安玲，
申请(专利权)人：皖西学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34