蛋白-药物偶联物和定点偶联方法技术

本申请涉及一种蛋白‑药物偶联物，其包含抗原结合蛋白部分和药物偶联物部分；所述抗原结合蛋白部分包括一个或多个抗原结合片段，以及与所述抗原结合片段直接或间接连接的至少两个连接肽；所述两个连接肽可各自独立地含有第一半胱氨酸Cys1和第二半胱氨酸Cys2；所述药物偶联物部分共价结合于所述Cys1上。本申请还涉及一种蛋白‑药物偶联物的制备方法，以及所述蛋白‑药物偶联物在预防或治疗肿瘤或其他疾病中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白-药物偶联物和定点偶联方法本申请要求申请日为2020年12月08日的中国专利申请202011423832.6的优先权。
本专利技术一般涉及生物医药领域，具体的涉及一种蛋白-药物偶联物以及一种制备所述蛋白-药物偶联物的方法。
技术介绍
抗体偶联药物(Antibody-DrugConjugate，ADC)是由靶向肿瘤抗原的抗体通过连接子与高效细胞毒性的小分子化学药物偶联产生的，利用抗体与靶抗原特异性结合的特点，将小分子药物靶向递送至肿瘤细胞进而发挥杀伤肿瘤的作用。近年来，随着新的连接子、小分子毒素、抗体以及靶点发现技术的不断发展，ADC早期的问题不断被克服，陆续有ADC药物的上市，在血液瘤、实体瘤展现良好的临床效果。另一方面，近年来，ADC技术也被应用于非肿瘤领域；例如，AbbVie公司将类固醇偶联于抗TNFα的抗体上用于治疗多种TNFα介导的自身免疫性疾病。偶联方法和连接子结构对于ADC药物的稳定性至关重要。半胱氨酸偶联技术是早期的化学偶联方法的代表；其利用IgG1抗体天然的4个链间二硫键作为偶联用的活性巯基，相较于赖氨酸酰胺偶联技术，该技术具有可控的DAR值(药物/抗体比)，但是仍产生DAR值为0到8的分布的混合物。由于此类技术产生的偶联产物成分不均一，其稳定性和药学性能有较大不足。近年来，随着细胞毒性药物与定点偶联方法的不断发展，第三代ADC技术通过药物与抗体经特定位点偶联获得稳定的DAR值，提高了抗体偶联药物的稳定性和药代动力学性能。第三代ADC代表的偶联技术主要包括ThioMab、ThioBridge、引入非天然氨基酸、转肽反应、N-糖链偶联等。ThioMab技术最早由Genentech公司开发，在半胱氨酸偶联技术基础上，其在抗体中的除天然二硫键以外的特定位点引入两个或多个半胱氨酸作为偶联位点，用以产生位点专一的DAR为2的高均质性的抗体偶联药物；但是由于其引入的突变不是天然存在的氨基酸序列，因而面临潜在的分子稳定性和免疫原性的风险。ThioBridge技术则是将单抗本身的二硫键还原，利用二溴马来酰亚胺或二溴吡啶二苯醚等试剂与还原的链间半胱氨酸反应，使其重新桥接，得到主要组分是DAR为4的产物，但是该技术仍有发生二硫键错配的风险。非天然氨基酸偶联技术使用一种特殊的编码非天然氨基酸的tRNA合成酶，使得细胞可以合成带有对乙酰苯丙氨酸(p-acetylphenylalanine)残基的各种抗体，利用对乙酰苯丙氨酸残基的羰基与带有烷氧基胺基团的连接子发生偶联反应，得到主要组分是DAR为2的产物；由于该技术需要使用经过改造的宿主细胞来产生非天然氨基酸，因而其明显的不足是抗体生产的产率较低而成本较高。利用转肽反应的偶联技术是在抗体的重链或轻链的C’末端引入一段序列LPETG，转肽酶SortaseA特异识别该序列并水解苏氨酸和甘氨酸间的肽键，然后再把含有甘氨酸的偶联物连接到苏氨酸上；但是该技术产生的偶联产物中引入了额外的肽段序列，因而也面临潜在的免疫原性的风险。N-糖链偶联技术如GlycoConnect技术使用内切糖苷酶EndoS2修剪位于抗体CH2区的Asn297(Eu编号)的糖链，然后使用突变的半乳糖转移酶GalT(Y289L)和N-叠氮基乙酰半乳糖胺(GalNAz)引入叠氮基，利用点击化学(ClickChemistry)将该叠氮基与小分子药物偶联，产生稳定且均匀的DAR为2的抗体偶联药物；由于该技术需要使用特殊的突变的酶，其工艺开发成本较高。目前，尽管已经开发了多种可以定点偶联产生具有可控的DAR值的偶联技术，但是这些技术或是引入氨基酸突变、或是引入额外的氨基酸序列、或是改变Fc上的糖链结构、或是引入非天然氨基酸，其工艺开发过程繁杂且成本较高。而且现有技术中没有通用的针对重链抗体、单链抗体或者双特异性抗体或者融合蛋白来制备蛋白-药物偶联物的偶联技术。因而仍亟需开发新的无需复杂的制备工艺的定点偶联技术，以提高偶联产物的稳定性，减少免疫原性。
技术实现思路
本申请提供了蛋白-药物偶联物的定点偶联方法及由该方法制备所得的蛋白药物偶联物。具有下列性质中的一种或多种：1)可以定点偶联产生均一DAR值(药物/抗体比)或均一CAR值(偶联物/抗体比)的偶联产物；2)相较于其他定点偶联技术如THIOMAB技术等，可利用天然铰链区氨基酸序列，不引入氨基酸突变或额外肽段序列，也不改变Fc上的糖链结构；3)可对天然铰链区的氨基酸序列进行长度或特定位点氨基酸种类的优化，提高产物的表达量和均一度；4)无需特别复杂的偶联技术或工艺；5)该定点偶联方法的副产物少，可开发性强；6)抗原结合片段可扩展到多种形式，全人VH结构域、骆驼科VHH结构域、单链抗体scFv、可溶性受体融合蛋白等；7)抗原结合片段可扩展成多价多特异性形式；8)有良好的稳定性和半衰期；9)有更好的靶细胞内化作用；10)有更好的组织穿透性。一方面，本申请提供了一种蛋白-药物偶联物，其包含抗原结合蛋白部分和药物偶联物部分；所述抗原结合蛋白部分包括一个或多个抗原结合片段，以及与所述抗原结合片段直接或间接连接的至少两个连接肽；所述至少两个连接肽包括第一连接肽和第二连接肽；其中，所述第一连接肽包含第一半胱氨酸Cys1和第二半胱氨酸Cys2，所述药物偶联物部分通过所述Cys1偶联至所述第一连接肽；且所述第二连接肽包含第一半胱氨酸Cys1和第二半胱氨酸Cys2，所述药物偶联物部分通过所述Cys1偶联至所述第二连接肽。在某些实施方式中，所述第一连接肽的所述Cys2与所述第二连接肽的的所述Cys2之间通过二硫键连接。在某些实施方式中，所述一个或多个抗原结合片段中不包含能够影响药物偶联物与所述第一连接肽和/或所述第二连接肽在Cys1处进行偶联的官能团或者前述官能团与其他药物偶联物形成的缀合物，所述影响表现为显著降低药物偶联物在Cys1位点的偶联几率。在某些实施方式中，所述一个或多个抗原结合片段中不包含能够与所述第一连接肽的所述Cys1和/或所述第二连接肽的所述Cys1形成二硫键的官能团或者前述官能团与其他药物偶联物形成的缀合物。在某些实施方式中，所述一个或多个抗原结合片段中不包含能够与所述第一连接肽的所述Cys1和/或所述第二连接肽的所述Cys1形成二硫键的半胱氨酸或者前述半胱氨酸与其他药物偶联物形成的缀合物。在某些实施方式中，所述第一连接肽和所述第二连接肽的氨基酸序列可以相同或不同。在某些实施方式中，所述第一连接肽和/或所述第二连接肽自N端至C端包含Cys1-(X)n-Cys2所示的氨基酸序列；其中，n为大于或等于3的整数，X是不为Cys的任意氨基酸。在某些实施方式中，所述第一连接肽和/或所述第二连接肽源自抗体铰链区序列或其衍生序列。其中，所述衍生序列为通过对抗体铰链区序列进行改造获得，所述改造不涉及抗体铰链区中Cys1和Cys2的改变。例如，所述改造为调整抗体铰链区序列中Cys1和Cys2之间的氨基酸种类、数目和/或在Cys1前进行柔性连接氨基酸的添加。在某些实施方式中，所述连接肽源自人IgG铰链区，例如，所述抗体铰链区为人Ig本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白-药物偶联物，其包含抗原结合蛋白部分和药物偶联物部分；所述抗原结合蛋白部分包括一个或多个抗原结合片段，以及与所述抗原结合片段直接或间接连接的至少两个连接肽；所述至少两个连接肽包括第一连接肽和第二连接肽；其中所述第一连接肽包含第一半胱氨酸Cys1和第二半胱氨酸Cys2，所述药物偶联物部分通过所述Cys1偶联至所述第一连接肽；且所述第二连接肽包含第一半胱氨酸Cys1和第二半胱氨酸Cys2，所述药物偶联物部分通过所述Cys1偶联至所述第二连接肽。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20201208 CN 2020114238326蛋白-药物偶联物，其包含抗原结合蛋白部分和药物偶联物部分；所述抗原结合蛋白部分包括一个或多个抗原结合片段，以及与所述抗原结合片段直接或间接连接的至少两个连接肽；所述至少两个连接肽包括第一连接肽和第二连接肽；其中所述第一连接肽包含第一半胱氨酸Cys1和第二半胱氨酸Cys2，所述药物偶联物部分通过所述Cys1偶联至所述第一连接肽；且所述第二连接肽包含第一半胱氨酸Cys1和第二半胱氨酸Cys2，所述药物偶联物部分通过所述Cys1偶联至所述第二连接肽。


根据权利要求1所述的蛋白-药物偶联物，其中所述第一连接肽的所述Cys2与所述第二连接肽的所述Cys2之间通过二硫键连接。


根据权利要求1或2所述的蛋白-药物偶联物，其中所述一个或多个抗原结合片段中不包含能够影响药物偶联物与所述第一连接肽和/或所述第二连接肽在Cys1处进行偶联的官能团或者前述官能团与其他药物偶联物形成的缀合物，所述影响表现为显著降低药物偶联物在Cys1位点的偶联几率。


根据权利要求1-3中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述一个或多个抗原结合片段不包含能够与所述第一连接肽的所述Cys1和/或所述第二连接肽的所述Cys1形成二硫键的官能团或者前述官能团与其他药物偶联物形成的缀合物。


根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述一个或多个抗原结合片段不包含能够与所述第一连接肽的所述Cys1和/或所述第二连接肽的所述Cys1形成二硫键的半胱氨酸或者前述半胱氨酸与其他药物偶联物形成的缀合物。


根据权利要求1-5中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述第一连接肽与所述第二连接肽相同或不同。


根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述第一连接肽的所述Cys1和所述Cys2之间相隔至少3个除半胱氨酸以外的任意氨基酸，和/或所述第二连接肽的所述Cys1和所述Cys2之间相隔至少3个除半胱氨酸以外的任意氨基酸。


根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述第一连接肽和/或所述第二连接肽自N端至C端包含Cys1-(X)n-Cys2所示的氨基酸序列；其中，n为大于或等于3的整数，X是除半胱氨酸以外的任意氨基酸。


根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述第一连接肽和/或所述第二连接肽源自抗体铰链区序列或其衍生序列。


根据权利要求9所述的蛋白-药物偶联物，其中所述抗体铰链区为IgG铰链区。


根据权利要求9或10所述的蛋白-药物偶联物，其中所述抗体铰链区为人IgG1铰链区(SEQIDNO:73)或者小鼠IgG2c铰链区(SEQIDNO:147)。


根据权利要求1-11中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述Cys1为人IgG1铰链区根据EU编码的Cys-220，或与之对应的半胱氨酸，或者所述Cys1为小鼠IgG2c铰链区的第一个半胱氨酸。


根据权利要求1-12中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述第一连接肽和所述第二连接肽的序列各自独立地如SEQIDNOs:73-105、145-147中任一项所示的氨基酸序列。


根据权利要求1-13中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述多个抗原结合片段连接于同一所述连接肽或分别连接于不同的所述连接肽。


根据权利要求1-14中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述多个抗原结合片段可以部分或全部相同或彼此均不同。


根据权利要求1-15中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述多个抗原结合片段包括第一抗原结合片段和第二抗原结合片段。


根据权利要求1-16中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述多个抗原结合片段进一步包含第三抗原结合片段和/或第四抗原结合片段。


根据权利要求1-17中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述一个或多个抗原结合片段可以各自独立地为VHH结构域、VH、VL、Fab、ScFv、受体蛋白可溶性胞外区、配体蛋白、脂质运载蛋白lipocalins、神经细胞粘附分子NCAM、纤维结合蛋白fibronectin和/或锚蛋白重复片段蛋白DARPins。


根据权利要求1-18中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述一个或多个抗原结合片段能够特异性结合肿瘤抗原或非肿瘤抗原。


根据权利要求19所述的蛋白-药物偶联物，其中所述肿瘤抗原包括CD19、BCMA、TSHR、CD171、CS-1、CLL-1、GD3、TnAg、FLT3、CD38、CD123、CD44v6、B7H3、B7H4、KIT、IL-13Ra2、IL-11Ra、PSCA、PSMA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-beta、SSEA-4、MUC1、EGFR、NCAM、CAIX、LMP2、EphA2、岩藻糖基GM1(fucosylGM1)、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、GD2、FOLR1、FOLR2、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、CLDN18.2、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多聚唾液酸(polysialicacid)、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TAARP、WT1、ETV6-AML、SPA17、XAGE1、Tie2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、FOSL1、hTERT、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、AR(雄激素受体)、细胞周期蛋白B1(CyclinB1)、MYCN、RhoC、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD20、CD30、HER2、ROR1、FLT3、TAAG72、CD22、CD33、GD2、gp100Tn、FAP、酪氨酸酶(tyrosinase)、EPCAM、CEA、IGF-1R、EphB2、间皮素(mesothelin)、钙黏蛋白17(Cadherin17)、CD32b、EGFRvIII、GPNMB、GPR64、HER3、LRP6、LYPD8、NKG2D、SLC34A2、SLC39A6、SLITRK6、GUCY2C、5T4和/或TACSTD2。


根据权利要求1-20中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述一个或多个抗原结合片段各自独立地包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，且所述抗原结合片段包含选自下述的任意一组氨基酸序列：(1)HCDR1：SEQIDNO:7，HCDR2：SEQIDNO:22，HCDR3：SEQIDNO:38；(2)HCDR1：SEQIDNO:10，HCDR2：SEQIDNO:25，HCDR3：SEQIDNO:41；(3)HCDR1：SEQIDNO:11，HCDR2：SEQIDNO:26，HCDR3：SEQIDNO:42；(4)HCDR1：SEQIDNO:13，HCDR2：SEQIDNO:28，HCDR3：SEQIDNO:44；(5)HCDR1：SEQIDNO:14，HCDR2：SEQIDNO:29，HCDR3：SEQIDNO:42；(6)HCDR1：SEQIDNO:9，HCDR2：SEQIDNO:24，HCDR3：SEQIDNO:40；和(7)HCDR1：SEQIDNO:8，HCDR2：SEQIDNO:23，HCDR3：SEQIDNO:39。


根据权利要求1-21中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述一个或多个抗原结合片段各自独立地包含VH，且所述VH包括SEQIDNOs:55-59、61和62中任一项所示的氨基酸序列。


根据权利要求1-22中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述一个或多个抗原结合片段各自独立地包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别依次包含SEQIDNO:12，SEQIDNO:27，SEQIDNO:43，SEQIDNO:49，SEQIDNO:51和SEQIDNO:53所示的氨基酸序列。


根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其中所述一个或多个抗原结合片段包含至少一对VH和VL，且所述一对VH和VL分别包括SEQIDNO:60和SEQIDNO:63所示的氨基酸序列；或者所述一个或多个抗原结合片段包含至少一对VH和VL和/或另一种VH，且所述一对VH和VL分别包括SEQIDNO:130和SEQIDNO:131所示的氨基酸序列，和所述另一种VH包括SEQIDNO:62所示的氨基酸序列。


根据权利要求1-24中任一项所述的蛋白-药物偶联物，其还包含与所述连接肽直接或间接连接的配对单元部分，所述配对单元包含至少第一配对亚单元和第二配对亚单元，且所述第一配对亚单元可以通过共价键或者非共价键与所述第二配对亚单元相互作用。


根据权利要求25所述的蛋白-药物偶联物，其中所述配对单元为抗体Fc片段或突变的Fc片段。


根据权利要求25或26所述的蛋白-药物偶联物，所述第一配对亚单元的N端与所述第一连接肽的C端连接，且所述第二配对亚单元的N端与所述第二连接肽的C端连接；或者，所述第一配对亚单元的N端与所述第二连接肽的C端连接，且所述第二配对亚单元的N端与所述第一连接肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：何云，石磊，曹旸，王明，张云，
申请(专利权)人：和铂医药上海有限责任公司，
类型：发明
国别省市：上海;31