一种稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系筛选方法及鉴定方法技术

本发明专利技术涉及稻瘟病抗性鉴定领域，具体涉及一种稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系筛选方法及鉴定方法。上述方法通过分子测定某一地区的稻瘟病菌群致病基因与无毒基因情况，根据测定结果进行聚类划分成不同的遗传宗谱，从不同的宗谱中筛选一定的菌株组成代表该地区稻瘟病菌群的抗性鉴定菌系，可以很好的为该地区的水稻抗病育种与抗病品种筛选提供有效的助力。该方法具有高效、准确、省时省力的特点，对水稻稻瘟病特别是穗颈瘟的抗性鉴定有很要的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系筛选方法及鉴定方法
本专利技术涉及稻瘟病抗性鉴定领域，具体涉及一种稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系筛选方法及鉴定方法。
技术介绍
水稻稻瘟病是一种世界性的重要真菌病害，病害流行的年份严重影响水稻产量和稻米品质，严重地区甚至颗粒无收。选育和利用抗病水稻品种是防治稻瘟病的最有效措施，但稻瘟病菌生理小种不断变化且变异较快，育成的抗病水稻品种通常种植数年后极易丧失抗性。因此，稻瘟病抗性鉴定工作对水稻品种的抗病安全布局来说是一项极其重要的工作，只有在水稻育种源头明确水稻品种的抗性，才能在实际生产中选择抗性好的品种，减少稻瘟病的发生造成损失。稻瘟病抗性鉴定主要有田间自然诱发鉴定与室内鉴定两种方法，田间自然诱发鉴定由于受当年气候等环境因素的影响往往不能够得到准确的水稻品种抗性结果，相对而言，室内稻瘟病鉴定可以人为的控制温度，湿度等稻瘟病发病条件能够充分保证抗性鉴定结果的准确性，但室内稻瘟病鉴定的一个关键因素是稻瘟病菌的选择，鉴定菌株必须具有某一地区菌群的代表性才能真实的反应水稻品种在该地区田间种植后能够表现的抗性水平。如何有效的筛选具有代表性的鉴定菌系是稻瘟病抗性鉴定特别是穗颈瘟抗性鉴定成功与否的关键所在。传统的稻瘟病抗性鉴定菌株筛选是通过苗期接种某些水稻品种后的抗感反应型来确定的，该方法具有一定的可行性，但接种结果容易受人员操作影响、且较耗时耗力；另外，由于该方法筛选的抗性鉴定菌株是通过水稻苗期接种结果确定的，是否对穗颈瘟抗性具有较好的鉴定能力却无法确定，没有证据表明水稻对苗(叶)瘟的抗性与穗颈瘟的具有绝对相关性。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中的稻瘟病抗性鉴定菌株筛选容易受人员操作影响，耗时耗力，造成对穗颈瘟抗性鉴定结果不够准确的缺陷，从而提供一种本方法通过分子测定某一地区的稻瘟病菌群致病基因与无毒基因情况，根据测定结果进行聚类划分成不同的遗传宗谱，从不同的宗谱中筛选一定的菌株组成代表该地区稻瘟病菌群的抗性鉴定菌系，可以很好的为该地区的水稻抗病育种与抗病品种筛选提供有效的助力。该方法具有高效、准确、省时省力的特点，对水稻稻瘟病特别是穗颈瘟的抗性鉴定有很重要的应用潜力。为此，本专利技术提供了如下的技术方案：一种稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系筛选方法，包括：S1、采集稻瘟病标本，然后进行稻瘟病菌单孢菌的分离、保存；S2、提取所述的稻瘟病菌单孢菌的DNA，以所述DNA为模板，以稻瘟病菌无毒基因与致病基因设计引物，进行PCR扩增，对稻瘟病菌无毒基因与致病基因进行测定；稻瘟病菌致病基因为MPG1、MPS1、MagB、CPKA、MNH1、MgYCA1、MgS11和MgATG5；稻瘟病菌无毒基因为Avr-pia、Avr-pit、Avr-pik、Avr-pita、Avr-pizt、Avr-co39、ACE1和PRE1；S3、对稻瘟病菌无毒基因与致病基因测定结果进行聚类分析，根据PCR扩增条带的结果，有条带记为“1”，无条带记为“0”，构建基于“0-1”数据库，应用NTSYS-PC数据处理系统计算遗传距离，以菌株DNA扩增条带的位置相似水平为基准，用最长距离法对菌株群体遗传多样性进行聚类分析，将菌株归类成不同的组，每一个组称为一个遗传宗谱，对遗传宗谱进行编号i；S4、设定稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系总菌株数N，计算每个遗传宗谱的稻瘟病菌株占所有菌株的百分比Mi，依据所述百分比的大小，由小到大依次计算对应遗传宗谱中随机挑选菌株数，在编号为i的遗传宗谱中随机挑选菌株Pi＝(N-W已挑选总和)×Mi个，Pi值取大于0整数，W已挑选总和表示编号1-编号i-1的遗传宗谱随机挑选菌株数之和，最后挑选出的菌株作为稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系。可选的，在S1步骤中，将采集的水稻穗颈部稻瘟病标本剪成5-8寸，浸水18-24h，然后用水冲洗2-3次，再用灭菌水冲洗1次，置于保湿培养皿中，于28℃恒温培养箱内暗培养2d，观察到标样上有灰色或灰绿色的孢子后，采用眉毛挑单孢法，将病部置于显微镜下挑取单个孢子在PDA斜面培养基中培养，纯培养后转接到放有灭菌滤纸片的PDA培养基培养，待滤纸片长满菌丝挑出放在在无菌的羊皮纸袋中，置于-80℃超低温冰箱保存。可选的，在S2步骤中，提取DNA的方法包括：将保存的稻瘟病菌株活化后，挑取菌丝接种到PD液体培养基中，置于120r/min摇床上28℃培养3～6d，将长出的菌丝体用灭菌纱布过滤收集、烘干并保存于-20℃备用；将收集的菌丝体分装于2mL的离心管中，加2颗直径为5mm灭菌碳钢珠后迅速加65℃预热的CTAB提取液，然后进行磨样，最后提取基因组DNA，保存于-20℃冰箱备用。可选的，在S2步骤中，对稻瘟病菌无毒基因与致病基因设计的引物如SEQIDNO.1-SEQIDNO.32所示。可选的，在S2步骤中，所述PCR扩增的体系如下：DNA模板1μL(≤200ng)；正向引物，浓度为0.2～0.4μmol/L，1μL；反向引物，浓度为0.2～0.4μmol/L，1μL；dNTP，浓度2.5mmol/L，0.5μL；TaqDNA聚合酶，浓度为5000U/ml，0.2μL；10×Buffer，含Mg2+，2μL；ddH2O，14.3μL。可选的，在S2步骤中，所述PCR扩增的反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，55～57℃退火1min，72℃延伸60～90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。可选的，在S3步骤中，以相似系数0.75进行分组。本专利技术提供了一种稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定方法，利用所述的稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系筛选方法中筛选出的稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系鉴定。可选的，采用离体穗段点滴接种法鉴定。可选的，选取待测水稻品种按大田正常栽培，待长至孕穗破口初期穗长露出1～2cm时从田间每一品种的小区内剪取稻穗20个，然后剪取长约7～8cm长的穗段，穗颈节上部2cm，下部5～6cm，然后将穗段放入双层过滤纸的培养皿内，每皿加2mL的无菌水浸润，在每根穗段的穗颈节位点及节下4cm处各滴入5μL的稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系的孢子悬浮液，每根穗段滴入一个抗性鉴定菌株的孢子悬浮液，将培养皿放入26℃的光照培养箱中，并用透明的薄膜包被，以保持培养皿内的湿度，光暗交替培养10-12天，离体接种培养12天后，检查各培养皿穗颈的发病情况，分级标准如下：0级：无病斑；1级：病斑长度不超过5mm；3级：病斑长度6～15mm；5级：病斑长度超过16mm，但病斑间不相连；7级：病斑相互联结，≥50％且＜80％穗段发病；9级：病斑相互联结，80％以上穗段发病；统计分级并计算平均病级；平均病级小于1为抗病；平均病级＞1且≤3为中抗；平均病级＞3，且≤5为中感；平均病级＞5且≤7为感病；平均病级＞7为高感；计算抗性频率％＝抗病菌株数/总菌株数×100％。本专利技术技术方案，具有如下优点1.本专利技术提供的一种稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系筛选方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系筛选方法，其特征在于，包括：/nS1、采集稻瘟病标本，然后进行稻瘟病菌单孢菌的分离、保存；/nS2、提取所述的稻瘟病菌单孢菌的DNA，以所述DNA为模板，以稻瘟病菌无毒基因与致病基因设计引物，进行PCR扩增，对稻瘟病菌无毒基因与致病基因进行测定；稻瘟病菌致病基因为MPG1、MPS1、MagB、CPKA、MNH1、MgYCA1、MgS11和MgATG5；稻瘟病菌无毒基因为Avr-pia、Avr-pit、Avr-pik、Avr-pita、Avr-pizt、Avr-co39、ACE1和PRE1；/nS3、对稻瘟病菌无毒基因与致病基因测定结果进行聚类分析，根据PCR扩增条带的结果，有条带记为“1”，无条带记为“0”，构建基于“0-1”数据库，应用NTSYS-PC数据处理系统计算遗传距离，以菌株DNA扩增条带的位置相似水平为基准，用最长距离法对菌株群体遗传多样性进行聚类分析，将菌株归类成不同的组，每一个组称为一个遗传宗谱，对遗传宗谱进行编号i；/nS4、设定稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系总菌株数N，计算每个遗传宗谱的稻瘟病菌株占所有菌株的百分比M

【技术特征摘要】
1.一种稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系筛选方法，其特征在于，包括：
S1、采集稻瘟病标本，然后进行稻瘟病菌单孢菌的分离、保存；
S2、提取所述的稻瘟病菌单孢菌的DNA，以所述DNA为模板，以稻瘟病菌无毒基因与致病基因设计引物，进行PCR扩增，对稻瘟病菌无毒基因与致病基因进行测定；稻瘟病菌致病基因为MPG1、MPS1、MagB、CPKA、MNH1、MgYCA1、MgS11和MgATG5；稻瘟病菌无毒基因为Avr-pia、Avr-pit、Avr-pik、Avr-pita、Avr-pizt、Avr-co39、ACE1和PRE1；
S3、对稻瘟病菌无毒基因与致病基因测定结果进行聚类分析，根据PCR扩增条带的结果，有条带记为“1”，无条带记为“0”，构建基于“0-1”数据库，应用NTSYS-PC数据处理系统计算遗传距离，以菌株DNA扩增条带的位置相似水平为基准，用最长距离法对菌株群体遗传多样性进行聚类分析，将菌株归类成不同的组，每一个组称为一个遗传宗谱，对遗传宗谱进行编号i；
S4、设定稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系总菌株数N，计算每个遗传宗谱的稻瘟病菌株占所有菌株的百分比Mi，依据所述百分比的大小，由小到大依次计算对应遗传宗谱中随机挑选菌株数，在编号为i的遗传宗谱中随机挑选菌株Pi＝(N-W已挑选总和)×Mi个，Pi值取大于0整数，W已挑选总和表示编号1-编号i-1的遗传宗谱随机挑选菌株数之和，最后挑选出的菌株作为稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系。


2.根据权利要求1所述的稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系筛选方法，其特征在于，在S1步骤中，将采集的水稻穗颈部稻瘟病标本剪成5-8寸，浸水18-24h，然后用水冲洗2-3次，再用灭菌水冲洗1次，置于保湿培养皿中，于28℃恒温培养箱内暗培养2d，观察到标样上有灰色或灰绿色的孢子后，采用眉毛挑单孢法，将病部置于显微镜下挑取单个孢子在PDA斜面培养基中培养，纯培养后转接到放有灭菌滤纸片的PDA培养基培养，待滤纸片长满菌丝挑出放在在无菌的羊皮纸袋中，置于-80℃超低温冰箱保存。


3.根据权利要求1或2所述的稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系筛选方法，其特征在于，在S2步骤中，提取DNA的方法包括：将保存的稻瘟病菌株活化后，挑取菌丝接种到PD液体培养基中，置于120r/min摇床上28℃培养3～6d，将长出的菌丝体用灭菌纱布过滤收集、烘干并保存于-20℃备用；将收集的菌丝体分装于2mL的离心管中，加2颗直径为5mm灭菌碳钢珠后迅速加65℃预热的CTAB提取液，然后进行磨样，最后提取基因组DNA，保存于-20℃冰箱备用。


4.根据权利要求1-3任一项所述的稻瘟病穗颈瘟抗性鉴定菌系筛选方法，其特征在于，在S2步骤中...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰波，杨迎青，孙强，赵凤，陈洪凡，李湘民，
申请(专利权)人：江西省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：江西;36