一种鉴定萝卜花色控制基因InDel标记及应用制造技术

本发明专利技术提供一种鉴定萝卜花色控制基因的InDel分子标记及应用，所述InDel分子标记正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物包括第一反向引物及第二反向引物，所述第一反向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，所述第二反向引物序列如SEQ ID NO.6所示。与现有技术相比，本发明专利技术的有益效果在于：通过检测提供的特异性片段的缺失或插入，在幼苗期即可检测萝卜花色，可用作后续鉴定及育种。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定萝卜花色控制基因InDel标记及应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种鉴定萝卜花色控制基因的InDel分子标记及应用。
技术介绍
萝卜(RaphanussativusL.)是我国重要的大宗蔬菜之一，属于十字花科萝卜属蔬菜作物。萝卜花色变异多样，具体可分为白色、紫色、红色、黄绿色等。萝卜花瓣颜色的变异的驱动力主要来源于对授粉者的吸引，进而影响自身的授粉效率及其结实率，是萝卜的重要农艺性状之一。采用传统的育种方法获得人们关注性状的相应品种工作量大，育种效率低且育种周期长。随着分子生物学的发展，分子标记辅助选择越来越成为一种重要的育种技术。分子标记辅助选择是利用分子标记对目标性状进行选择，在苗期就可以对杂交后代进行筛选，可极大的减少工作量、缩短育种周期、提高育种效率。分子标记辅助选择是植物遗传育种中广泛使用的技术，可供使用的分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、InDel和SNP等。在上述几种分子标记方式中，RFLP、RAPD和AFLP数量均较少且检测方式繁琐，SNP分子标记开发成本和检测成本高昂，而InDel分子标记由于不需要使用二次测序和试剂盒检测，因此具有操作简便，检测成本低的优势。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种鉴定萝卜花色控制基因InDel标记及应用。具体技术方案如下：一种与萝卜花色相关的插入/缺失片段，其不同之处在于，序列如SEQIDNO.1所示。与萝卜花色相关的插入变异/缺失变异起始于7号染色体的5098497bp上述插入/缺失片段在选育或鉴别萝卜花色中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：通过检测提供的特异性片段的插入/缺失，可在幼苗期即可检测萝卜花色，可用作后续鉴定及育种。一种鉴定萝卜花色InDel分子标记的引物，其不同之处在于，所述InDel分子标记引物的正向引物序列如SEQIDNO.4所示，反向引物包括第一反向引物及第二反向引物，所述第一反向引物序列如SEQIDNO.5所示，所述第二反向引物序列如SEQIDNO.6所示。该分子标记在鉴定序列如SEQIDNO.1所示的基因片段在萝卜组织基因型中缺失还是插入中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：相较于采用传统的两条正反引物对进行检测，本专利技术采用一条正向引物及两条反向引物检测2228bp的插入片段，同时将扩增时间减少至30s，提高检测效率。一种包括上述引物的试剂盒。与现有技术相比，可以通过试剂盒进行扩增进行快速检测。一种利用上述InDel分子标记引物鉴定萝卜花色的方法，其不同之处在于，采用一组3条引物鉴定所述萝卜花色，方法包括：以萝卜基因组DNA为模板，采用上述InDel分子标记引物扩增，检测萝卜组织基因型中，序列如SEQIDNO.1的基因片段是插入还是缺失，判断萝卜花色呈白色还是呈紫色；如萝卜组织基因的基因型为插入所述基因片段的纯合子，则萝卜花色呈白色；如萝卜组织基因的基因型为缺失所述基因片段的纯合子，则萝卜花色呈紫色；如萝卜植株组织基因的基因型为同时含有所述基因片段插入等位基因与缺失等位基因的杂合子，则萝卜花色呈紫色。与现有技术相比，本专利技术通过InDel分子标记引物检测萝卜组织的基因型，可以快速在幼苗期即可判定萝卜花色。进一步，控制所述萝卜花色的基因为RsF3′H。采取上述进一步技术方案的有益效果在于：可以检测萝卜组织的F3′H基因型，即可快速判定萝卜花色。进一步，所述鉴定萝卜花色的方法还包括萝卜基因组DNA的提取，将萝卜叶磨碎后加入提取液提取。进一步，扩增条件为95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，进行40个循环；72℃延伸10min，10℃10min。进一步，若只检测到328bp的条带，表明样品的基因型为所述基因片段插入的纯合子；若只检测到500bp的条带，表明样品的基因型为缺失所述基因片段的纯合子；若同时检测到500bp和328bp的条带，表明样品的基因型为同时含有所述基因片段插入等位基因与缺失等位基因的杂合子。附图说明图1为白花萝卜“55”与紫花萝卜“QZ-16”材料植株与花色照片(a)及其F2群体中表型个数(b)；图2为萝卜花色控制基因RsF3′H的编码序列变异及引物扩增示意图；图3为本研究中3条引物组合的InDel分子标记的检测结果；其中，P1为正向引物，P2为第一反向引物，P3为第二反向引物。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例1本研究使用湖北省蔬菜种质创新与遗传改良湖北省重点实验室萝卜自交系“QZ-16”(紫花)和萝卜自交系“55”(白花)进行杂交获得F1，F1自交获得F2花色分离群体(图1)。遗传分析结果显示，“QZ-16”与“55”的F1后代花色均为紫色。在309株F2群体中，有238株紫花植株和71株白花植株，如图1所示，分离比例为3：1(χ2＝0.67,P＝0.42>0.05)，符合孟德尔遗传比例。因此，萝卜紫花性状为单基因控制的显性遗传。为了鉴定控制萝卜花色Pf基因，采用图位克隆的方法鉴定到控制萝卜花色的目的基因。采用BSA联合全基因组重测序方法(即QTL-seq)对Pf基因进行初定位，在F2分离群体中选择20株紫花植株构建“紫花池”，20株白花植株构建“白花池”，对两个混合池进行基因组重测序。QTL-seq显示萝卜紫花控制基因初步定为在7号染色体前端。进一步通过连锁分析，最终将目的基因定位于5.00Mb-5.17Mb之间，物理距离约为170kb，遗传距离约为0.32cM。该区域内鉴定到一个类黄酮3′-羟化酶(Flavonoid3′-Hydroxylase,F3′H)基因，命名为RsF3′H。RsF3′H基因是花青苷合成途径中重要催化酶。RsF3′H序列分析结果显示(如图2)，“QZ-16”中RsF3′H基因组序列(序列如SEQIDNO.2)及其编码序列均正常，而“55”的基因组序列中有一个2,228bp的反转座子(序列如SEQIDNO.1)，该反转座子插入位点位于外显子上(序列如SEQIDNO.3)，因此插入产生移码突变导致目的基因失去功能。因此，将RsF3′H认为是控制萝卜紫花性状的目标基因，而该反转座子导致RsF3′H基因在两个亲本之间存在较大的序列差异，可开发为对应的InDel标记。为快速检测RsF3′H基因的插入片段，开发了3个引物，设计思路如下：由于插入片段超过2000bp长度，PCR扩增时间长，且难以扩增，不适用于大批量检测，因此设计了该通过多重PCR扩增检测插入片段的插入/缺失：正向引物和第一反向引物分别位于RsF3′H基因的外显子上和3′UTR端，反向第二引物位于插入片段上。通过将PCR延伸时间缩短为30s，则原插入长片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与萝卜花色相关的插入/缺失片段，其特征在于，序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种与萝卜花色相关的插入/缺失片段，其特征在于，序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种利用权利要求1所述的插入/缺失片段在选育或鉴别萝卜花色中的应用。


3.一种用于鉴定萝卜花色的InDel分子标记引物，其特征在于，所述InDel分子标记引物正向引物序列如SEQIDNO.4所示，反向引物包括第一反向引物及第二反向引物，所述第一反向引物的序列如SEQIDNO.5所示，所述第二反向引物序列如SEQIDNO.6所示。


4.一种包括权利要求3所述的引物的试剂盒。


5.一种鉴定萝卜花色的方法，其特征在于，方法包括：
以萝卜基因组DNA为模板，采用权利要求3的InDel分子标记引物扩增，检测萝卜组织基因型中序列如SEQIDNO.1的基因片段是插入还是缺失，判断萝卜花色呈白色还是呈紫色；
如萝卜组织基因的基因型为插入所述基因片段的纯合子，则萝卜花色呈白色；
如萝卜组织基因的基因型为缺失所述基因片段的纯合子，则萝卜花色呈紫色；
如萝卜植株组...

【专利技术属性】
技术研发人员：严承欢，邱正明，黄燕，崔磊，邓晓辉，矫振彪，刘志雄，张振兴，朱凤娟，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42