一种鉴别山葡萄性别的分子标记及其鉴别方法技术

本发明专利技术公开一种鉴别山葡萄性别的分子标记引物及鉴别方法，属于分子鉴别技术领域。主要包括以下步骤：提取山葡萄叶片DNA；利用分子标记引物对所提取的DNA进行PCR扩增；PCR扩增产物经聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分离并拍照；根据电泳图中的条带情况对山葡萄进行性别鉴定。本发明专利技术所述鉴别方法能够在育苗阶段对山葡萄交子代的性别进行早期鉴定，尽早淘汰雄株，筛选出具有优良性状杂交子代雌株，提高山葡萄杂交子代的早期选择效率，降低育种成本，有利于杂交育种工作的顺利开展，推动育种和产业发展，及推动山葡萄产业的顺利发展。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别山葡萄性别的分子标记及其鉴别方法
本专利技术属于分子鉴别
，具体涉及一种鉴别山葡萄性别的分子标记及鉴别方法。
技术介绍
山葡萄(V.amurensisRupr.)为葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis)植物，是原产我国的特色野生果树，是葡萄属中最抗寒的种类，枝蔓可抵御-40℃的严寒，根系可承受-16℃的低温，且对多种欧亚种群易感的病害有较强的抵抗力，是国内外葡萄抗寒、抗病育种的宝贵资源。杂交育种是进行种质创新和良种培育的重要手段。山葡萄在自然条件下为雌雄异株，山葡萄育种大多以山葡萄雌花作母本、雄花作父本杂交，在后代中筛选可结实的雌能花优株，但是山葡萄生长周期和童期较长，在实生苗处于童期的几年内确定性别较为困难，这严重限制了具有优良性状杂交后代雌株的早期筛选，同时在育苗及种植管理过程中也花费了大量劳动成本与经济成本。因此，有必要研究开发高效稳定的山葡萄性别鉴定分子标记，在育苗阶段对山葡萄幼苗性别进行早期鉴定，对加速育种进程及育苗成本控制具有重要意义。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种鉴别山葡萄性别的分子标记及鉴别方法，利用分子标记在育苗阶段对山葡萄的性别进行早期鉴定，对提高山葡萄杂交后代雌株的早期选择效率及降低杂种圃的管理成本具有重要意义。为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供了一种鉴定山葡萄性别的分子标记，在雌株上只存在SEQIDNO.1所示核苷酸序列，在雄株上同时存在SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；SEQIDNO.1所示的核苷酸序列：TTGCCAAGCCATTAAGACTCTCCATGGAGACCCAAACCTTGGGGTGTTGACCATGCCCACAACAACCAACACCGTTAAATCAGGGTGTTATCAGGGATCGGGATTCGAACTTGGGACAATGTGCCTCTTACTGGGACCGCACGTCCCAACTTTCGCCTTGACCAACTAGGCCTACCCTAGTGGGCTAACATCCTATTTTTATTATTGACACCTATTGTATGATCAATATTCTTGTCTTGTTTCCCATTCTTC。SEQIDNO.2所示的核苷酸序列：TTGCCAAGCCATTAAGACTTTCCATGGAGACCCAAACCTCGGGGTGTTGACCATGCCCACAACAACCAGCACCGTTAAATCAGGATGTTATCAGGAATAGGATTTGAACTTGGGACCATGTACCTCTTACTGGGACACCATGTACCTCTTACTGGGACCACACGTCCCAACATTCACCTTGAACAACTGGGCCTACCCTGGTGGGCTAACATCCTATTTTTATTATTGACACCTATTGTATGATCAATATTCGTGTCTTGTTTCCCATTCTTC。进一步地，所述分子标记通过如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的特异性引物扩增获得，SEQIDNO.3为正向引物，SEQIDNO.4为反向引物；SEQIDNO.3所示的核苷酸序列为:5’-TTGCCAAGCCATTAAGAC-3’；SEQIDNO.4所示的核苷酸序列为:5’-GAAGAATGGGAAACAAGACA-3’。本专利技术另一方面提供了一种鉴别山葡萄性别的方法，主要包括如下步骤：(1)提取山葡萄DNA；(2)利用如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的正向引物和反向引物对步骤(1)所提取的DNA进行PCR扩增；(3)将步骤(2)所得的PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离并拍照；(4)根据步骤(3)所得的电泳图中的条带情况对山葡萄进行性别鉴定。进一步地，步骤(1)的具体步骤包括：a)取山葡萄幼嫩叶片，研磨成粉末后，转入预热至50～70℃的溴化十六烷基三甲铵CTAB缓冲液中，50～70℃水浴提取10～200min，1000～20000rpm离心5～30min；b)小心吸取步骤a)所得的上清液，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿和异戊醇体积比为24：1，涡旋混匀，5000～20000rpm离心5～30min，取上清液，加入2倍体积预冷至-30～-10℃的乙醇或异丙醇；c)将步骤b)所得的溶液于5000～20000rpm离心5～30min，弃上清液；用体积分数为60～80％的乙醇清洗沉淀物2-5次；晾干后，加入预热至55～75℃的ddH2O，即得到山葡萄基因组DNA；d)利用1.0％琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000分光光度计检测步骤c)所得的DNA样品的纯度和浓度，于-20℃冰箱保存。进一步地，在步骤(2)中，PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，重复循环32次，72℃延伸5min。进一步地，在步骤(2)中，PCR扩增的体系为：TaqDNA聚合酶10μL；5μM正向引物2μL；5μM反向引物2μL；模板DNA1μL；加入ddH2O补齐到20μL。进一步地，在步骤(3)中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体步骤为：PCR扩增产物用10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离；所述聚丙烯酰胺凝胶电泳条件设置为220V、400mA，电泳时间为90min。进一步地，电泳凝胶上显示有1条位于252bp处的条带的为雌株，电泳凝胶上显示有2条分别位于252bp和273bp处的条带的为雄株。本专利技术另一方面提供SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的分子标记、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的分子标记引物在制备鉴定山葡萄性别的试剂或试剂盒中的用途。本专利技术相对于现有技术具有的有益效果如下：1.本专利技术采用分子标记技术鉴别山葡萄性别，先提取山葡萄DNA，再使用本专利技术提供的分子标记引物进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并拍照，即可根据目的条带的数量鉴别出山葡萄性别。2.本专利技术可以在育苗阶段将雌雄单株区分开，鉴定结果的准确率为100％，无需等到山葡萄开花后再鉴定性别，能够在育苗阶段对山葡萄杂交后代的性别进行早期鉴定。3.本专利技术提高了山葡萄杂交后代的早期选择效率，降低育种成本，有利于杂交育种工作的顺利开展，推动育种和产业发展，及推动山葡萄产业的顺利发展。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。图1为山葡萄雌、雄亲本及其117株杂交后代的PCR扩增电泳图，其中，p1：雌株亲本；p2：雄株亲本；m：雄株后代；f：雌株后代；M：300bpDNAMarker。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的说明，但本专利技术的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本专利技术的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定山葡萄性别的分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴定山葡萄性别的分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.一种扩增权利要求1所述的分子标记的引物。


3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，所述的引物包括如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的特异性引物，
SEQIDNO.3所示的核苷酸序列为:5’-TTGCCAAGCCATTAAGAC-3’；
SEQIDNO.4所示的核苷酸序列为:5’-GAAGAATGGGAAACAAGACA-3’。


4.一种鉴别山葡萄性别的方法，其特征在于，主要包括如下步骤：
(1)提取山葡萄DNA；
(2)利用权利要求2或3所述的引物对步骤(1)所提取的DNA进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)所得的PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离并拍照；
(4)根据步骤(3)所得的电泳图中的条带情况对山葡萄进行性别鉴定。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤包括：
a)取山葡萄幼嫩叶片，研磨成粉末后，转入预热至50～70℃的溴化十六烷基三甲铵CTAB缓冲液中，50～70℃水浴提取10～200min，1000～20000rpm离心5～30min；
b)小心吸取步骤a)所得的上清液，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿和异戊醇体积比为24：1，涡旋混匀，5000～20000rpm离心5～30min...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘镇东，阎军毅，林洪，李季睿，门岩，李通，李坤，郭印山，郭修武，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21