【技术实现步骤摘要】
一种生姜青枯病雷尔氏菌的PCR检测方法
本专利技术涉及生姜青枯病雷尔氏菌检测
，具体为一种生姜青枯病雷尔氏菌的PCR检测方法。
技术介绍
为了明确引起湖北生姜青枯病的病原菌及建立快速准确的检测技术，本方法对自湖北恩施采集的生姜病样进行分离，基于形态学特征，分子生物学和致病性测定的方法对其进行鉴定，从已报道的青枯雷尔氏菌的特异性引物进行筛选验证，获得条带的特异性引物，创建并优化PCR反应条件，建立生姜青枯病PCR检测技术，为生姜青枯病害的早期预防、诊断及防控提供技术支持。为有效防控生姜青枯病，本专利技术对湖北恩施的生姜青枯病病样进行分离，基于形态学特征、分子生物学和致病力测定对其进行鉴定，并采用PCR技术对已报道的21F-21R特异性引物进行特异性和灵敏度检验，创建并优化PCR检测方法。该专利技术对生姜青枯病雷尔氏菌的分离鉴定及PCR检测方法的建立，为指导生姜青枯病的早期预测和防治提供重要的参考依据和技术支持。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种...
【技术保护点】
1.一种生姜青枯病雷尔氏菌PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)生姜青枯病病害调查、样品采集与病原菌的分离：/n生姜青枯病雷尔氏菌的分离在前人的基础上加以改进；从湖北恩施采集的样品中分离得到10株菌落形态和颜色与标准青枯雷尔氏菌相近的菌株，分别命名为ES202023～ES202033，选取ES202023菌株为代表作为形态学和分子生物学鉴定的候选菌株；/n2)形态学鉴定：/nES202023在TTC培养基上表面湿润有光泽，流动性极强，生长到第三天菌落中间出现粉红色，革兰氏染色的结果显示菌株为革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状，形态与标准菌株青枯雷尔氏菌一致；/n3)分子...
【技术特征摘要】
1.一种生姜青枯病雷尔氏菌PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)生姜青枯病病害调查、样品采集与病原菌的分离：
生姜青枯病雷尔氏菌的分离在前人的基础上加以改进；从湖北恩施采集的样品中分离得到10株菌落形态和颜色与标准青枯雷尔氏菌相近的菌株，分别命名为ES202023～ES202033，选取ES202023菌株为代表作为形态学和分子生物学鉴定的候选菌株；
2)形态学鉴定：
ES202023在TTC培养基上表面湿润有光泽，流动性极强，生长到第三天菌落中间出现粉红色，革兰氏染色的结果显示菌株为革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状，形态与标准菌株青枯雷尔氏菌一致；
3)分子生物学鉴定：
以提取的基因组为模板，以16SrDNA通用引物16S-F和16S-RPCR扩增16SrDNA序列，得到1400bp的特异片段，将测序得到的16SrDNA序列在NCBI数据库进行BLAST搜索后获取相关种属的16SrDNA序列，对比发现：与已经报道的青枯雷尔氏菌Ralstoniasolanacearum16S(登录号：MN830162.1)序列相似性为99.9％，下载相似度较高的多条序列、同属序列和外群序列，与ES202023序列一起，用MEGA7.0软件按邻接法构建系统进化树；
ES202023与多条青枯雷尔氏菌聚在同一分支上，结合形态学特征与分子生物学鉴定，将菌株ES202023鉴定为青枯雷尔氏菌；
4)致病力测定：
将活化后的菌株ES202023接种健康的生姜苗上，以接种无菌水为对照，观察菌株对生姜的致病性，结果显示，接种ES202023的生姜植株在第3天后生姜叶片逐步变成深褐色，然后蔓延到周边地区，最后慢慢枯萎，两周后植株全部死亡，这与采集的生姜青枯病的植株表现出来的症状完全一致。
5)生姜青枯病雷尔氏菌PCR检测方法的建立：
S1、检索国内外关于生姜青枯病雷尔氏菌的分子检测报道，选取特异性引物21R-21F，用引物21F和21R对所有供试菌株基因组DNA进行扩增，电泳检测，仅青枯菌基因组DNA能扩增除一条125bp的特异性条带，其他对照菌株与阴性对照均无扩增现象，并且对扩增产物经克隆测序后，通过GenBank上BLAST比对，同源性均达到99％，因此...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘奕清，张玲玲，周洁，刘燃，张天晓，周弦，贾切，
申请(专利权)人：长江大学，湖北美田生物科技有限公司，重庆市幅沅农业生物技术研究院有限公司，荆州农业科学院，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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