牛胚胎分割的方法和所用的分割液技术

本发明专利技术涉及牛胚胎分割的方法和所用的分割液。所述牛胚胎分割的方法包括如下步骤：采集卵母细胞并使其进行体外成熟；使精子悬液与成熟的卵母细胞在受精培养液滴孵育以完成体外受精；体外受精操作完毕后使胚胎在胚胎培养液中培养至桑椹胚生长良好，显微镜下挑选出桑椹胚；在无菌塑料平皿中用分割液制作分割液滴；将分选的桑椹胚用分割液洗2次，接着移入PBS液中预处理，然后移入分割液滴内，置于倒置显微镜下，用固定管固定住胚胎，用分割刀逐渐由上向下压胚胎将胚胎一分为二；用吸管将分割所得半胚移入另一干净的分割液滴内处理10min，接着移入胚胎培养液中培养，至桑椹胚发育成可用于胚胎移植的扩张囊胚。本发明专利技术方法和所用的分割液呈现如说明书所述优异技术效果。

【技术实现步骤摘要】
牛胚胎分割的方法和所用的分割液
本专利技术属于动物繁殖
，涉及一种用于农业-畜牧兽医繁殖的技术，具体涉及一种牛体外胚胎分割的方法，另外，本专利技术还涉及牛胚胎分割所用试液在牛胚胎分割中的应用。本专利技术牛胚胎分割的方法具有优异的技术效果。
技术介绍
随着现代农业科技的发展，为了更充分利用良种母牛的繁殖潜力，加速遗传育种进程，在生产实践中应用高效的繁殖新技术成为必然。活体采卵(OvumpickUP，OPU)和体外受精技术(InVitroFertilization，IVF)是二十世纪八十年代快速发展起来的胚胎工程新技术，二者相结合可获得大量遗传系谱明确的胚胎，从而缩短世代间隔。目前，这两种技术已经成为欧美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群而采用的重要繁殖技术。另外，基于活体采卵和体外受精技术延伸出来的胚胎分割技术，亦是加速遗传育种进程的有力工具。胚胎分割技术在刘永华文献(刘永华，等，哺乳动物胚胎分割技术研究进展，中国畜牧兽医，2007，34(3):52)中有详细阐述，其全部内容通过引用并入本文。具体地说，胚胎分割是指将哺乳动物的胚胎采用手术或非手术的方法从子宫或输卵管中取出，人为的利用机械或化学方法，将胚胎分割成2个或多个部分，分割后的每个部分在适宜的条件下进行体外培养、移植回受体子宫或输卵管(或不经过培养直接移植)，可从1枚胚胎获得2个或多个基因型和表型一致的后代。胚胎分割技术可用于扩增可用的优良胚胎的数目和生产同卵双胎、同卵多胎的克隆动物，可用于濒危动物的保护，也可为早期胚胎遗传疾病的检查和性别鉴定等技术提供一种活体组织检查的方法。哺乳动物胚胎分割技术始于Nicholas(1942)对大鼠2-细胞胚胎卵裂球的分离和培养研究。Tarkowski(1959)发现一半卵裂球已经被破坏的2-细胞小鼠胚胎可以发育成囊胚，并生出了小鼠，其后，他研究了小鼠1/4、2/4、3/4卵裂球的发育规律，其结果表明：早期胚胎的每个卵裂球都具有发育全能性，即能发育成正常个体，并通过胚胎分割得到了世界上首例半胚来源的活体动物。Mullen等(1970)将小鼠2-细胞胚胎的2个卵裂球分离，经培养后再移植给受体，产生了哺乳动物的第一例人工双胞胎。此后，动物胚胎分割技术迅速发展起来，并在20世纪80年代中后期达到了一个高潮。Willadsen(1979)最初用显微手术方法，分别将绵羊2-细胞胚和桑椹胚一分为二或一分为四，再将所分得的卵裂球用琼脂包埋，在绵羊输卵管内培养3～5d，取出后将胚胎剥离移植给受体，获得同卵双胞胎和同卵四胞胎。但是此法中间环节多，操作烦琐，难以在生产上应用推广。1981年，他去除了绵羊4细胞期胚胎的透明带，使4个分裂球分离，移植给受体后得到同卵四羔与同卵三羔。同年，Willadsen又与Ploge合作，将8-细胞期的牛胚胎分割为4个1/4胚，并获一同卵三胎，一对同卵双胎和一单胎。Willadsen(1980)首先将胚胎分割技术与胚胎超低温冷冻技术结合起来，利用绵羊冷冻保存半胚获得3只活羔羊。1984年他改进了方法，分割较晚期的胚胎(桑椹胚或囊胚)，分割后的胚胎可以不经过培养直接移植，因而具有很大的实用价值。Gyu-Jin(1998)又利用卵母细胞体外成熟、体外受精的方法获得了牛胚胎，移植12枚四分胚到6头受体，得到2头四分胚的犊牛。这为胚胎分割技术又开辟了新的研究和应用领域。哺乳动物的胚胎从2-细胞期到囊胚期都可以分割并生出后代，对于胚胎分割的方法，主要是根据胚胎发育阶段不同而异。在2～8细胞期，胚胎的分割(卵裂球的分离)主要有机械法和化学辅助机械法。而桑椹胚、囊胚分割是哺乳动物的胚胎分割的主要执行阶段，在此阶段，典型的有Willadsen分割法、Williams分割法、TSuzuki分割法、显微吸管分离法、酶软化透明带显微玻璃针分割法、徒手分割法等。郑海英文献(郑海英，等，不同分割液对水牛胚胎分割效果的影响，畜牧与兽医，2009，41(7)：32)记载了对牛胚胎进行分割的方法，然而这些方法仍然有一定的局限性。对桑椹胚进行高效的胚胎分割仍是本领域技术人员迫切期待的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牛胚胎分割的方法，尤其是对桑椹胚高效地进行胚胎分割的方法。本专利技术人出人意料地发现，使用本专利技术方法能够获得本专利技术所述一个或者多个方面的技术效果，本专利技术基于此类发现而得以完成。为此，本专利技术第一方面涉及一种牛胚胎分割的方法，其包括如下步骤：(1)采集卵母细胞并使其进行体外成熟；(2)使精子悬液与成熟的卵母细胞在受精培养液滴孵育以完成体外受精；(3)体外受精操作完毕后使胚胎在胚胎培养液中培养至桑椹胚生长良好，显微镜下挑选出桑椹胚；(4)在无菌塑料平皿中用分割液制作分割液滴；将分选的桑椹胚用分割液洗2次，接着移入PBS液中预处理，然后移入分割液滴内，置于倒置显微镜下，用固定管固定住胚胎，用分割刀逐渐由上向下压胚胎将胚胎一分为二；(5)用吸管将分割所得半胚移入另一干净的分割液滴内处理10min，接着移入胚胎培养液中培养，至桑椹胚发育成可用于胚胎移植的扩张囊胚。根据本专利技术第一方面的方法，其中所述的牛选自：中国黄牛、荷斯坦牛、西门塔尔牛、中国水牛。根据本专利技术第一方面的方法，步骤(1)中，采集卵母细胞是照下述方式进行的：活体采集：对牛进行活体采卵，将所得卵泡液在体视显微镜下捡出至少含3层卵丘细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，放入包含HEPES的成熟培养液中38.8℃、3h内运回实验室；或者，离体采集：取屠宰场卵巢盛放于加双抗生理盐水的保温桶中，31~33℃条件下，3h内运回实验室；抽取表面2~8mm的卵泡，收集沉淀，在体视显微镜下捡出至少含有3层卵丘细胞包裹的卵母细胞COCs(即，卵丘-卵母细胞复合体)，在洗卵液中洗涤2遍，去除多余杂质。根据本专利技术第一方面的方法，步骤(1)中，卵母细胞体外成熟是照下述方式进行的：采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22~24h，培养条件为38.8℃、5.5~6.5%CO2、饱和湿度，使卵母细胞体外成熟。根据本专利技术第一方面的方法，步骤(2)体外受精是照下述方式进行的：将成熟的COCs在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；从液氮中取一支冻精细管，37℃水浴解冻；无菌操作剪开细管两端，使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中，328×g离心2次，每次5min，离心后弃上清；将300µL精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液进行精子计数；将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中，并将培养盘放入培养箱，使精卵共孵育16-20h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5%CO2、饱和湿度，完成体外受精。根据本专利技术第一方面的方法，步骤(3)是照如下方式进行胚胎体外培养和分选桑椹胚的：体外受精操作完毕后，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牛胚胎分割的方法，其包括如下步骤：/n(1)采集卵母细胞并使其进行体外成熟；/n(2)使精子悬液与成熟的卵母细胞在受精培养液滴孵育以完成体外受精；/n(3)体外受精操作完毕后使胚胎在胚胎培养液中培养至桑椹胚生长良好，显微镜下挑选出桑椹胚；/n(4)在无菌塑料平皿中用分割液制作分割液滴；将分选的桑椹胚用分割液洗2次，接着移入PBS液中预处理，然后移入分割液滴内，置于倒置显微镜下，用固定管固定住胚胎，用分割刀逐渐由上向下压胚胎将胚胎一分为二；/n(5)用吸管将分割所得半胚移入另一干净的分割液滴内处理10min，接着移入胚胎培养液中培养，至桑椹胚发育成可用于胚胎移植的扩张囊胚。/n

【技术特征摘要】
1.牛胚胎分割的方法，其包括如下步骤：
(1)采集卵母细胞并使其进行体外成熟；
(2)使精子悬液与成熟的卵母细胞在受精培养液滴孵育以完成体外受精；
(3)体外受精操作完毕后使胚胎在胚胎培养液中培养至桑椹胚生长良好，显微镜下挑选出桑椹胚；
(4)在无菌塑料平皿中用分割液制作分割液滴；将分选的桑椹胚用分割液洗2次，接着移入PBS液中预处理，然后移入分割液滴内，置于倒置显微镜下，用固定管固定住胚胎，用分割刀逐渐由上向下压胚胎将胚胎一分为二；
(5)用吸管将分割所得半胚移入另一干净的分割液滴内处理10min，接着移入胚胎培养液中培养，至桑椹胚发育成可用于胚胎移植的扩张囊胚。


2.根据权利要求1的方法，其中：
所述的牛选自：中国黄牛、荷斯坦牛、西门塔尔牛、中国水牛；
步骤(1)中，采集卵母细胞是照下述方式进行的：活体采集：对牛进行活体采卵，将所得卵泡液在体视显微镜下捡出至少含3层卵丘细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，放入包含HEPES的成熟培养液中38.8℃、3h内运回实验室；或者，离体采集：取屠宰场卵巢盛放于加双抗生理盐水的保温桶中，31~33℃条件下，3h内运回实验室；抽取表面2~8mm的卵泡，收集沉淀，在体视显微镜下捡出至少含有3层卵丘细胞包裹的卵母细胞COCs(即，卵丘-卵母细胞复合体)，在洗卵液中洗涤2遍，去除多余杂质；或
步骤(1)中，卵母细胞体外成熟是照下述方式进行的：采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22~24h，培养条件为38.8℃、5.5~6.5%CO2、饱和湿度，使卵母细胞体外成熟。


3.根据权利要求1的方法，其中：
步骤(2)体外受精是照下述方式进行的：
将成熟的COCs在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；
从液氮中取一支冻精细管，37℃水浴解冻；无菌操作剪开细管两端，使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中，328×g离心2次，每次5min，离心后弃上清；将300µL精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液进行精子计数；或
将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中，并将培养盘放入培养箱，使精卵共孵育16-20h，培养条件为38.8℃、5.5-6.5%CO2、饱和湿度，完成体外受精。


4.根据权利要求1的方法，其中：
步骤(3)是照如下方式进行胚胎体外培养和分选桑椹胚的：体外受精操作完毕后，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，此时记为胚胎培养的第1天，培养条件为38.8℃、6%O2、88%N2、饱和湿度，于第5天在立体显微镜下挑选生长良好的桑椹胚，用于胚胎分割的操作；
步骤(4)是照如下方式进行桑椹胚的分割的：在直径为100mm的无菌塑料平皿中，用分割液制作若干个分割液滴，每个100μL；将分选的桑椹胚用分割液洗2次，接着移入PBS液中预处理20min，然后移入分割液滴内，置于倒置显微镜下；将胚胎分割刀与玻璃固定管安装于显微操作仪上，用固定管固定住胚胎，用分割刀逐渐由上向下压胚胎将胚胎一分为二；或
步骤(4)是照如下方式进行分割胚的发育的：用吸管将分割所得半胚移入另一干净的分割液滴内处理10min，接着移入胚胎培养液中培养(38.8℃、6%O2、88%N2、饱和湿度)24h，至桑椹胚发育成可用于胚胎移植的扩张囊胚。


5.根据权利要求1的方法，其中：
所述分割液为包含如下组分的灭菌水溶液：9.39g磷酸氢二钾、3.5g磷酸二氢钾、68g蔗糖、12g聚维酮K30、注射用水至1000ml；例如，其使用如下常规方法制得：将各物料加适量注射用水溶解，补加注射用水至1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟；或者
所述分割液为包含如下组分的灭菌水溶液：9.39g磷酸氢二钾、3.5g磷酸二氢钾、68g蔗糖、12g聚维酮K30、1.6g酮苯丙氨酸钙、4.5g丙二醇、注射用水至1000ml；例如，其使用如下常规方法制得：将各物料加适量注射用水溶解，补加注射用水至1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。


6.根据权利要求1的方法，其中：
所述包含HEPES的运输培养液，其中包含：甘氨酸50.0mg/L、L-丙氨酸25.0mg/L、L-精氨酸盐酸盐70.0mg/L、L-天冬氨酸30.0mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐26.0mg/L、L-谷氨酸75.0mg/L、L-谷氨酰胺100.0mg/L、L-组氨酸盐酸盐一水合物21.88mg/L、L-羟基脯氨酸10.0mg/L、L-异亮氨酸40.0mg/L、L-亮氨酸60.0mg/L、L-赖氨酸盐酸盐70.0mg/L、L-甲硫氨酸15.0mg/L、L-苯丙氨酸25.0mg/L、L-脯氨酸40.0mg/L、L-丝氨酸25.0mg/L、L-苏氨酸30.0mg/L、L-色氨酸10.0mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物58.0mg/L、L-缬氨酸25.0mg/L、抗坏血酸0.05mg/L、生物素0.01mg/L、氯化胆碱0.5mg/L、D-泛酸钙0.01mg/L、叶酸0.01mg/L、甲萘醌0.01mg/L、烟酰胺0.025mg/L、烟酸0.025mg/L、对氨基苯甲酸0.05mg/L、盐酸吡哆醛0.025mg/L、盐酸吡哆醇0.025mg/L、核黄素0.01mg/L、盐酸硫胺素0.01mg/L、维生素A醋酸酯0.1mg/L、维生素D2即骨化醇0.1mg/L、α-生育酚磷酸钠盐0.01mg/L、肌醇0.05mg/L、无水氯化钙200.0mg/L、硝酸铁九水合物0.7mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钾400.0mg/L、氯化钠6800.0mg/L、磷酸二氢钠一水合物140.0mg/L、硫酸腺嘌呤10.0mg/L、5'-磷酸腺苷0.2mg/L、三磷酸腺苷1.0mg/L、胆固醇0.2mg/L、葡萄糖1000.0mg/L、脱氧核糖0.5mg/L、还原型谷胱甘肽0.05mg/L、盐酸鸟嘌呤0.3mg/L、次黄嘌呤钠0.354mg/L、酚红20.0mg/L、核糖0.5mg/L、醋酸钠50.0mg/L、胸腺嘧啶0.3mg/L、吐温80为20.0mg/L、尿嘧啶0.3mg/L、黄嘌呤钠0.3mg/L，以及0.01IU/mL的FSH、0.01IU/mL的LH、1μg/mL的E2，50ng/mL的EGF、100ng/mL的IGF、10%庆大霉素、55µg/mL丙酮酸钠、1.2mM/L半胱氨酸、3mg/mL的BSA、10mM/L的HEPES，以及牛磺酸40mg/L、葡萄糖酸锌2mg/L；
所述加双抗生理盐水是包含青霉素400IU/mL、链霉素400μg/mL的生理盐水；
所述洗卵液是添加了3mg/mL牛血清白蛋白的BY基础培养液；
所述成熟培养液是添加了100mL/LFBS、10μg/mLFSH、10μg/mLLH、1μg/mLE2、20ng/mLEGF的BY基础培养液；
所述包含HEPES的成熟培养液是添加了15mmol/LHEPES、100mL/LFBS、10μg/mLFSH、10μg/mLLH、1μg/mLE2、20ng/mLEGF的BY基础培养液；
所述受精培养液，其包含：112.0mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM的氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的水溶液；
所述精液制备培养液，其包含：112.0mM氯化钠、4.02mM氯...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩勇权，王小武，王娜，陈建美，郭春明，许晓椿，
申请(专利权)人：天津博裕力牧科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12