发酵液中猪肌红蛋白的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了发酵液中猪肌红蛋白的分离纯化方法，属于生物技术领域。本发明专利技术通过在发酵液中创造性地分步添加不同浓度的硫酸铵，对表达猪肌红蛋白的重组毕赤酵母的发酵液进行浓缩，并对其进一步超滤浓缩，并对浓缩液进行纯化得到的肌红蛋白纯度达88.04％，纯化率可达66.05％，实现了从发酵液中纯化猪肌红蛋白，解决了之前猪肌红蛋白发酵液难以纯化的问题，并实现了猪肌红蛋白发酵液的高效纯化。本发明专利技术的分离纯化方法特异性高，操作条件温和，步骤简洁，纯化效果好，回收率高，成本低，速度快，益于扩大生产。

【技术实现步骤摘要】
发酵液中猪肌红蛋白的分离纯化方法
本专利技术涉及发酵液中猪肌红蛋白的分离纯化方法，属于生物

技术介绍
肌红蛋白是一种单亚基血红素蛋白，存在于一些无脊椎动物的肌肉中，也存在于大多数脊椎动物的心肌和骨骼肌中。在肌肉组织肌浆中肌红蛋白能可逆地与氧结合，具有转运和储存氧的作用，赋予了肌肉组织鲜红的颜色。近年来，随着人造肉技术的发展，肌红蛋白的添加可以使得人造肉制品更逼真地模拟真肉的颜色。目前从发酵液中分离纯化蛋白通常有亲和层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析，且大多依托于AKTA蛋白纯化仪。在大多报道中，最常用的是亲和层析中的His标签纯化，使目的蛋白与镍离子结合，后用咪唑洗脱，从而进行纯化。通常用于酶制剂的任何纯化标签都不能用于食品加工，所以不能采用His标签进行纯化。因而无法将常用的蛋白纯化方法直接应用于分离食品级的蛋白。蛋白的纯化，首先得解决发酵液浓缩的问题。在利用毕赤酵母重组菌发酵生产猪肌红蛋白的时候，发酵液含有消泡剂，而消泡剂会对大多数的超滤膜造成不可逆的溶解反应，导致目的蛋白无法达到浓缩的目的。其次得解决蛋白降解的问本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.从微生物发酵液中分离纯化猪肌红蛋白的方法，其特征在于，利用如(a)～(c)任一所述方法从发酵液中分离纯化猪肌红蛋白；/n(a)盐析-脱盐-阴离子交换法；/n(b)盐析-脱盐-凝胶过滤层析法；/n(c)浓缩-阴离子交换法；/n所述发酵液为利用表达猪肌红蛋白的重组毕赤酵母发酵得到的，所述猪肌红蛋白的NCBI Reference Sequence为NP_999401.1。/n

【技术特征摘要】
1.从微生物发酵液中分离纯化猪肌红蛋白的方法，其特征在于，利用如(a)～(c)任一所述方法从发酵液中分离纯化猪肌红蛋白；
(a)盐析-脱盐-阴离子交换法；
(b)盐析-脱盐-凝胶过滤层析法；
(c)浓缩-阴离子交换法；
所述发酵液为利用表达猪肌红蛋白的重组毕赤酵母发酵得到的，所述猪肌红蛋白的NCBIReferenceSequence为NP_999401.1。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组毕赤酵母是以毕赤酵母X33为宿主表达猪肌红蛋白；
所述发酵液的制备包括以下步骤：
(1)一级种子培养：将保存的所述重组毕赤酵母进行活化，在15～35℃，100～600rpm的条件下培养16-18h；
(2)二级种子培养：将一级种子液以体积比1～5％的量接种到种子培养基中，在15～35℃，100～600rpm的条件下培养至OD600＝6～8；
(3)发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中，发酵罐培养，控制DO为20％～40％，搅拌转速200-800rpm，通气量0.5～2.5VVM；
(4)发酵上清的制备：发酵至少84h后，取发酵液离心去除菌体，上清液采用真空抽滤，并进行收集得到发酵液。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述猪肌红蛋白通过添加硫酸铵进行浓缩。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，向发酵上清中缓慢加入硫酸铵粉末并搅拌至硫酸铵浓度达到50～60％饱和度，于1～4℃静置2h；4℃，5000～10000g离心25～35min收集上清；向上清中加入硫酸铵粉末，至硫酸铵浓度达到60～70％，于1～4℃静置过夜；5000～10000g离心25～35min收集沉淀；用10mM、pH9.20的Tris-HCl缓冲液将沉淀复溶得到浓缩液。


5.根据权利要求4所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵鑫锐，张博涵，周景文，堵国成，李江华，陈坚，钱源，
申请(专利权)人：江南大学，江苏东汇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32