一种大黄鱼血红蛋白抗菌肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种大黄鱼血红蛋白抗菌肽(LCH4)，其氨基酸序列为AWQKFLSAVVSALGR。所述抗菌肽的分子量为1633Da。本发明专利技术又公开了一种大黄鱼血红蛋白抗菌肽的应用，在预防或抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和海豚链球菌等细菌中的应用。本发明专利技术为后续进一步研究大黄鱼血红蛋白抗菌肽作为食品防腐剂和防止鱼病的饲料添加剂开发奠定了基础。

A haemoglobin antibacterial peptide of Pseudosciaena crocea and its application

【技术实现步骤摘要】
一种大黄鱼血红蛋白抗菌肽及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种大黄鱼血红蛋白抗菌肽及其应用。
技术介绍
致病微生物引起的食源性疾病是消费者、行业和监管机构面临的主要问题。据估计，约有6亿人(约占世界人口的十分之一)在食用受污染食品后患病，每年造成42万人死亡。在过去几十年中，使用化学合成防腐剂导致了各种与健康相关的问题。同时，我国养殖业在快速发展过程中出现病害严重和滥用药物等问题。抗菌肽是生物体产生的多种免疫因子，对细菌具有良好的抑制作用，有望成为化学防腐剂和养殖药物的替代品。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是食品中最受关注的致病微生物。金黄色葡萄球菌广泛分布于包括人类在内的许多温血动物的皮肤和粘膜上，在制备和加工过程中会污染食物；大肠杆菌也是食品中最常见的食源性病原体之一，被认为是主要的公共卫生风险。海豚链球菌具有感染宿主广、传染性强和死亡率高等特点，多呈急性嗜神经组织病症，给水产养殖业造成巨大损失。许多抗菌肽是从自然界生物内获得的。这种直接来源于生物体内的抗菌肽一般浓度很低(＜10-6)，很难得到足够的量去进行活性测定、结构鉴定和商业应用。大黄鱼(Larimichthyscrocea)是中国网箱养殖中最大的鱼类。已在大黄鱼中鉴定出几种抗菌肽家族，包括piscidin、LEAP-2和NK-lysin。血红蛋白不仅是氧载体蛋白，而且是海洋生物免疫系统的重要组成部分，但目前还没有在大黄鱼血红蛋白中发现抗菌肽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种大黄鱼血红蛋白抗菌肽及其应用，通过大黄鱼血红蛋白抗菌肽LCH4对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和海豚链球菌抑菌活性的研究，为寻找新的食品防腐剂和预防鱼病水产饲料添加剂提供实验依据，促进我国食品和水产养殖行业的健康、持续发展。为了解决上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种大黄鱼血红蛋白抗菌肽LCH4，其氨基酸序列AWQKFLSAVVSALGR，如SEQIDNO：1所示。研究表明大黄鱼血红蛋白的二级结构中富含α螺旋结构，这是抗菌肽典型功能结构，因此利用大黄鱼血红蛋白为目标寻找抗菌肽存在理论依据。我们首先对大黄鱼血红蛋白序列筛选和计算，然后通过Swiss-model和I-Tasser服务器对大黄鱼的血红蛋白结构进行预测，发现了对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和海豚链球菌具有很强抗菌作用的抗菌肽序列AWQKFLSAVVSALGR，命名LCH4，分子量为1633Da。圆二色谱测定其二级结构含量为：α-螺旋含量为60.3％；β-折叠含量为3.7％；β-转角含量为26.7％，无规则卷曲含量为9.3％。抗菌肽LCH4可以从至少如下两方面对细菌造成破坏：一方面，吸附在细菌细胞膜表面，破坏细胞膜导致细菌死亡；另一方面，破坏细胞膜的同时改变细菌细胞膜的通透性，并抑制细胞膜生成，导致细菌死亡。本专利技术还提供了上述大黄鱼血红蛋白抗菌肽的编码基因。本专利技术还提供了上述编码基因的表达盒。本专利技术还提供了上述编码基因的重组菌。本专利技术还提供了上述编码基因的重组载体。本专利技术还提供了上述编码基因的转基因细胞系。本专利技术还提供了上述多肽、编码基因、重组载体或转基因细胞系在抑制细菌的用途。优选的，上述细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、海豚链球菌中的一种或多种。优选的，上述抑制细菌的用途为用于制备食品防腐剂。本专利技术对人正常肝细胞具有极低的毒性，可用做为食品防腐剂应用，特别是作为预防食品常见致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等病菌污染的防腐剂。优选的，上述抑制细菌的用途为用于制备治疗或预防鱼病的饲料添加剂。本专利技术还可作为治疗或预防海豚链球菌的预防鱼病添加剂，在水产饲料中应用。本专利技术的抗菌肽可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行纯化，例如高效液相色谱法。实施本专利技术，具有如下有益效果：本专利技术以大黄鱼血红蛋白为研究对象，并通过筛选和计算，发现一个全新氨基酸序列的多肽LCH4。研究LCH4对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和海豚链球菌等细菌的抑菌活性；并以金黄色葡萄球菌为例利用透射电镜观察LCH4对其破坏程度；利用激光共聚焦显微镜观察LCH4是否能吸附在细菌表面；最后对它的人体安全性影响进行评估。实验结果表明，该肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和海豚链球菌等细菌具有强烈的抑制作用。它的抑菌机理是首先吸附在细菌表面，然后破坏细菌的细胞膜，并抑制膜的生成，，同时它对人体正常肝细胞毒性极低。本专利技术为LCH4作为食品防腐剂和水产饲料添加剂提供了实验依据。附图说明图1为本专利技术抗菌肽LCH4对金黄色葡萄球菌最低抑制浓度(MIC)测定对照图，其中，A：抗菌肽浓度0μg/mL；B：抗菌肽浓度62.5μg/mL；C：抗菌肽浓度31.25μg/mL；D：抗菌肽浓度15.6μg/mL；E：抗菌肽浓度7.8μg/mL；F：抗菌肽浓度3.9μg/mL。图2为本专利技术抗菌肽LCH4对大肠杆菌最低抑制浓度(MIC)测定对照图，其中，A：抗菌肽浓度0μg/mL；B：抗菌肽浓度62.5μg/mL；C：抗菌肽浓度31.25μg/mL；D：抗菌肽浓度15.6μg/mL；E：抗菌肽浓度7.8μg/mL；F：抗菌肽浓度3.9μg/mL。图3为本专利技术抗菌肽LCH4对海豚链球菌最低抑制浓度(MIC)测定对照图，其中，A：抗菌肽浓度0μg/mL；B：抗菌肽浓度250μg/mL；C：抗菌肽浓度125μg/mL；D：抗菌肽浓度62.5μg/mL；E：抗菌肽浓度31.25μg/mL；F：抗菌肽浓度15.6μg/mL。图4为本专利技术抗菌肽LCH4作用金黄色葡萄球菌的透射电镜观察图，其中，A：金黄色葡萄球菌空白对照组；B：LCH4处理后的金黄色葡萄球菌。图5为本专利技术抗菌肽LCH4作用大肠杆菌的透射电镜观察图，其中，A：大肠杆菌空白对照组；B：LCH4处理后的大肠杆菌。图6为本专利技术抗菌肽LCH4作用海豚链球菌的透射电镜观察图，其中，A：海豚链球菌空白对照组；B：LCH4处理后的海豚链球菌。图7为本专利技术抗菌肽LCH4处理金黄色葡萄球菌细胞的共聚焦显微镜观察图，其中，A：荧光图像；B：明视野像；C：合并图像。图8为本专利技术抗菌肽LCH4对金黄色葡萄球菌细生物膜形成的抑制作用柱状图，其中，*表示显著性p<0.05；**表示显著性p<0.005；***表示显著性p<0.001。图9为本专利技术抗菌肽LCH4的预测模型结构视图。图10为本专利技术抗菌肽LCH4对正常人肝细胞(LO2细胞)活力的影响柱状图。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本专利技术保护范围的限制，任何在本专利技术基础上做出的改变和变化，都在本专利技术的保护范围之内。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大黄鱼血红蛋白抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种大黄鱼血红蛋白抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.一种如权利要求1所述大黄鱼血红蛋白抗菌肽的编码基因。


3.含有如权利要求2所述编码基因的表达盒。


4.含有如权利要求2所述编码基因的重组菌。


5.含有权利要求2所述编码基因的重组载体。


6.含有如权利要求2所述编码基因的转基因细胞系。


7.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨燊，董玉婷，李健，袁紫金，倪辉，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35