一种低高聚体含量聚合血红蛋白的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种低高聚体含量聚合血红蛋白的制备方法，具体提供了交联血红蛋白的制备方法，包括：a、稀释脱氧血红蛋白；b、交联剂戊二醛与所述稀释脱氧血红蛋白发生交联反应；c、加入还原剂终止交联反应,用超滤换液的方式除去未反应的交联剂和终止还原剂,得到交联血红蛋白；其中：所述步骤a中，稀释脱氧血红蛋白浓度到1‑3g/dL，在所述血红蛋白中加入N‑乙酰‑L‑半胱氨酸，使溶液中血红蛋白与N‑乙酰‑L‑半胱氨酸的质量比为5‑10:1；且血红蛋白与交联剂的质量比为1000:29‑45。该方法制备的聚合血红蛋白中，不仅二聚体的含量较低，高聚体的含量也较低。

A preparation method of polymeric hemoglobin with low and high polymer content

【技术实现步骤摘要】
一种低高聚体含量聚合血红蛋白的制备方法优先权信息本专利申请要求申请日为2019年9月9日，专利技术名称为“交联血红蛋白的制备方法及包含该血红蛋白的器官灌注液”的中国专利申请201910846580.9的优先权，该优先权申请在此全文引用作为参考。
本专利技术属于生物制药领域，涉及血红蛋白的聚合方法，特别涉及低高聚体含量聚合血红蛋白的制备方法。
技术介绍
输血对于外科手术、抢险抗灾和战场救护来说是必不可少的医疗手段。近年来，全世界对输血用血液的需求量成几何级数增长。但是由于人类血液的血型十分复杂，输血反应始终难以克服，而天然血液的储存和运输又极为困难，再加上HBV以及HIV等病毒对血液污染严重，献血人员数量严重不足等众多原因，使得安全有效的血源日益紧缺。因此，红细胞代用品就成为国际关注的研究热点，并被列为二十一世纪的重大研究开发领域。理想的红细胞代用品要求具有天然红细胞的传递氧功能、生物相容性、安全性和稳定性，即：①具有较高的携氧能力，氧分压在正常生理范围内，能有效向组织供氧；②与人血液所有组分具有良好的生物相容性；⑦能维持血液渗透压、酸碱平衡、粘稠度和血容量；④无免疫原性(无制敏原性)、无血液病原微生物污染、无热源；＠体内循环半寿期在24h以上，在正常灌注条件下不产生肾毒性等副作用；⑥在低温条件下，产品保质期大于6个月；⑦具有预期的可清除性。目前研制的红细胞代用品主要可分为基于血红蛋白的各类制品(HemoglobinBasedOxygenCarrier，HBOC),全合成的氟碳类化合物两大类。<br>全氟碳化合物是一种合成的化合物，具有高携氧能力，在21.3KPa(160mmHg)氧分压和37℃条件下可溶解40％-50％容积的氧。虽然全氟碳化合物不溶于水，但经表面活性剂乳化即可进行输注。日本大阪绿十字公司生产的20％全氟萘烷(Flousol-DA20TM),是目前被FDA批准在美国使用的携氧扩容剂，用于冠状动脉成形术后冠状动脉灌流。全氟碳化合物的高溶氧性对治疗呼吸困难综合症效果显著。但全氟碳化合物所携带的氧会立即释放，难以运载到某些缺氧组织，同时氧会在部分组织中积累引起组织损伤，另外具有储存不便，在体内代谢较慢，存在类似感冒症状的副作用，它的生物相容性和携氧能力均不及血红蛋白，其长期使用的效果和安全性尚未完全有保证，因此其应用具有一定局限性。血红蛋白是生物体内载送氧的生物分子，在人、牛、马等动物血液中，存在于红细胞内。由于其本身是蛋白质，不需配血型，而其易于制备和长期保存，具有替代红细胞载氧功能的潜力。血红蛋白是红细胞的组成物质之一，具有高效的载氧能力和维持胶体渗透压的功能。血红蛋白来源广泛，包括人，动物，重组血红蛋白等等，可以通过交联，共轭，聚合等方式制备成红细胞代用品。这些修饰的主要目的就是要延长血红蛋白在血液循环中的保留时间，减少毒性并保证其向组织释氧。当前各国开始把以血红蛋白为基质的红细胞代用品作为血液代用品研究开发的主要方向。以游离血红蛋白为原料研制红细胞代用品，必须对血红蛋白进行改造，使其符合人体内的生理需要。化学修饰血红蛋白是研究途径之一，通过化学方法在分子水平上对血红蛋白分子进行改造，即在体外将血红蛋白的活性基团通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变血红蛋白的性质，这就是血红蛋白的化学修饰。表面修饰的血红蛋白是血红蛋白分子和大分子的共轭产物(如葡聚糖、聚乙二醇、右旋糖苷)。对血红蛋白进行表面修饰主要目的是延长血红蛋白在血管中的停留时间。在1964年Chang报道把血红蛋白与聚合物交联，可以形成一种不溶性的偶合血红蛋白。后来Wong对这一技术进行了改进，将右旋糖苷与血红蛋白交联可以形成可溶性的偶合血红蛋白。美国Sangart公司研发Hemospan(MP4，聚乙二醇(PEG)修饰的人血红蛋白)为新一代红细胞代用品。PEG与水相互作用力较强，使血红蛋白表面形成一层水“防护膜”，能够消除免疫原性、增加有效分子半径、延长体内半衰期和提供与血液相似的粘滞度，防止血管收缩，保持正常运送和释放氧气的能力。分子内交联血红蛋白是指应用一些小分子物质在血红蛋白亚基如α亚基和β亚基：αβ和αβ之间形成比较稳定的共价键，从而稳定血红蛋白分子。1968年，Bund和Jandl报道了能进行分子内交联的双官能团试剂bis(N-maleimidomethyl)，它与血红蛋白反应会形成交联的四聚体以阻止四聚体血红蛋白分子的解离，从而延长其在血管中的停留时间。后来BaxterHealthcare发展了这一技术，采用3,5-二水杨酸-二延胡索酸对血红蛋白进行分子内交联，形成a链间DBBF交联的人血红蛋白，Baxter将其称为DCLHb和HemAssistTM。然而临床实验显示有非常显著的血管活性，现已经中断研究。聚合血红蛋白是应用双功能试剂如戊二醛，使血红蛋白分子之间进行聚合形成一个多聚血红蛋白分子的稳定的聚合产物。双功能交联试剂包括戊二醛，Chang最先应用双功能交联剂对血红蛋白活性氨基酸残基进行交联，得到聚合血红蛋白。Northfield公司的产品PolyHeme是使用吡哆醛首先将人血红蛋白进行分子内交联，然后用戊二醛进一步进行分子间交联，使得聚合血红蛋白分子量变大。Biopure公司生产的HemopureTM，采用戊二醛对纯化的牛血红蛋白进行交联，形成聚合牛血红蛋白，这产品已经在南非通过了临床实验，并已上市。由此可知，戊二醛为交联剂的聚合血红蛋白是红细胞代用品中研究最多，最早进入Ⅲ期临床和在部分国家上市的一种产品。戊二醛聚合血红蛋白的制备工艺可以大致分为以下几个步骤：血红蛋白的粗纯、血红蛋白的精纯、血红蛋白聚合(修饰)。在这三个步骤中，血红蛋白的聚合工艺较为重要。因为虽然戊二醛是一种制备聚合血红蛋白最常用的同型双功能交联剂，但戊二醛也存在很多缺点：它有两个醛基，所以反应活性很高；它有长的碳链，导致有利于发生分子间交联，使得聚合血红蛋白的分子量过大；无特异性反应位点，血红蛋白表面约有40个赖氨酸侧链氨基以及四个链端氨基可以参与反应，使得聚合难以控制。戊二醛的上述缺点最终表现为溶液中的聚合血红蛋白分子的大小不一，分子量分布从32kD到1000kD以上。这种宽分子量分布不但使血红蛋白有效利用率降低，而且过低的分子量稳定性差，容易离解造成肾毒性，携氧效率低，另外，还使高聚体聚合血红蛋白的含量升高。尽管高平均分子量不会改变聚合血红蛋白的载氧特性，但会降低血浆的胶体渗透压并增加粘度，进而影响其血液动力学特性和组织供氧能力。因此，美国食品与药品局在回复Biopure公司戊二醛聚合牛血红蛋白Ⅲ期临床试验的批文中明确要求降低平均分子量。因此，血红蛋白的聚合工艺不但是整个工艺的关键，也是制约聚合血红蛋白商业化的瓶颈。
技术实现思路
为了解决上述问题，专利技术人通过大量的实验探索，令人惊讶地发现，血红蛋白的稀释浓度、血红蛋白与戊二醛的质量比、血红蛋白与N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)的质量比是制约聚合工艺的三个重要因素，具体地：<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种交联血红蛋白的制备方法，其包括如下步骤：/na、稀释脱氧的血红蛋白到X

【技术特征摘要】
20190909 CN 20191084658091.一种交联血红蛋白的制备方法，其包括如下步骤：
a、稀释脱氧的血红蛋白到X1；向所述稀释脱氧的血红蛋白中加入终浓度为X2的N-乙酰-L-半胱氨酸，得到反应液；将所述反应液移到无氧反应容器内；
b、在所述无氧反应容器顶部固定压力雾化器，在所述雾化器上接入进气管与进液管，在所述无氧反应容器顶部接上平衡气管路；封闭所述无氧反应容器，开启底部搅拌转子，通过水浴夹套加热所述反应液到42℃；打开进液管阀门，加入交联剂戊二醛，调整进液速度为X3，打开进气管阀门，通入惰性气体，优选高纯氮气，调控所述平衡气管路上的排气阀，使所述无氧反应容器的压力平衡在X4，按1g血红蛋白X5戊二醛的比例向所述反应液中加入所述交联剂戊二醛进行交联反应；
c、加入硼氢化钠终止所述交联反应，30kD超滤换液纯化，得到所述交联血红蛋白；...

【专利技术属性】
技术研发人员：游可为，史国营，张彦鹏，石松，陈浩源，
申请(专利权)人：润方北京生物医药研究院有限公司，润方北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11