交联血红蛋白的制备方法及包含该血红蛋白的器官灌注液技术

本发明专利技术公开了一种交联血红蛋白的制备方法，其包括如下步骤：a、稀释脱氧血红蛋白，加入到无氧反应器中；b、无氧反应器顶部设置雾化器，交联剂通过所述雾化器加入反应器中，发生交联反应；c、加入还原剂终止交联反应,用超滤换液的方式除去未反应的交联剂和终止还原剂,得到交联血红蛋白。本发明专利技术制得的交联血红蛋白含有较低含量的大分子(大于500kD)和小分子(小于64KD)，加入到器官灌注液中能够解决现行灌注液因缺少携氧剂而引起器官的酸中毒和溶酶体酶激活不良后果及再灌注时产生过量的自由基损伤细胞的现象，其制备、储存、运输及使用均十分简单方便。

Preparation method of crosslinked hemoglobin and organ perfusion solution containing the hemoglobin

【技术实现步骤摘要】
交联血红蛋白的制备方法及包含该血红蛋白的器官灌注液
本专利技术涉及医疗技术中器官保存
，特别是涉及一种交联血红蛋白的制备方法，尤其还涉及包含该交联血红蛋白的器官灌注液。
技术介绍
人类很多的疾病来自细胞、组织、器官坏死，从而导致功能丧失，引发人体残疾，甚至死亡，随着现代医学的发展，器官移植技术日趋成熟，单从手术角度来说：器官移植技术已很完美，换头手术都不是大问题。而事实上，器官移植目前仍面临种种困难，对离体器官的保存就是其中之一。器官移植必需移植活的器官，因此，供移植用的器官，从切离供者体内之时起直到其主要血管与受者血管接通期间，始终保持着完整的解剖结构和活性，是移植成功的一个前提。但是，任何器官一旦失去血液供应，细胞的得不到所必需的氧和养料，在常温(35-37度)下于短期内即会死亡。能耐受的时间是极短的，如心、肝仅10-15分钟，肾约在45-60分钟，若超过上述时限，移植后就很难恢复功能。在临床实际工作中，则要求常温下的缺血时间越短越好，最好不超过3-5分钟，最长不超过7-8分钟。根本不可能在如此短促的时间内完成移植手术。因此，必需设法使离体器官的活性能长时间维持。为延长对离体器官的保存时间，科学家探讨了多种方法，其中，低温保存是现在较常用的一种方法，但其虽然可以有效延长器官的保存时间，可低温保存对细胞的损伤也很明显，正常情况下，细胞浸浴在高钠低钾的细胞外液内，细胞膜内的Na-KATP酶(Na泵)细胞内外钠、钾比，钠、钾交换由氧化磷酸化供能。当代谢被抑制，Na泵得不到ATP供给，细胞内蛋白产生胶体渗透压致细胞水肿。细胞内蛋白质与非透过性阴离子产生渗透拉力大约110-140mOsm/kg。低温缺血、Na泵活性受到抑制时，细胞膜电位降低。继而Na和Cl因浓度梯度而进入细胞内，为维持半透膜内外侧水平衡，所以细胞内水聚积致使细胞水肿。再者，采用灌注的方式延长离体器官的保存也是较为常用的方法，目前常用的灌注液有Krebs-Henseleit液、StThomasⅡ液，UW液和Celsior液等，但这些灌注液都缺少携氧剂，使灌注的器官始终处理缺氧状态。体外灌注液若不能向离体器官有效供氧，组织和细胞就会因缺氧而增加无氧酵解，造成酸中毒和溶酶体酶激活不良后果。保证氧的供应、维持最低能量代谢和排除代谢废物是器官体外保存中亟待解决的问题。同时，在缺氧的条件下保存的器官，在其移植再灌注中会造成显著的二次损伤,恢复血流加重保存器官损害的机理尚不完全明了,一般认为与氧自由基损害作用有关,正常情况下,ATP的代谢产物次黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶(XOD)迅速地转变为嘌呤进而转变为中产物尿酸.然而,在缺氧严重的情况下,高能键很快耗尽,次黄嘌呤含量增加,XOD转变为一种能产生过氧化物的酶。同时，缺氧也使内源性抗氧化剂如过氧化物歧化酶(SOD)失活或耗尽，当血循环重建氧供突然增加就会产生过量的自由基损伤细胞。所以，在器官灌注液中加入携氧剂显得尤为重要。红细胞是动物体内天然的氧载体，曾有人将其直接用于器官体外灌注保存。而红细胞容易发生破裂,膜内氨基磷脂、内毒素、血型糖蛋白和胞内酶的外渗都可能损伤血管内皮及心肌细胞并造成毛细血管阻塞。采用无基质血红蛋白代替红细胞是一条新思路。但是，脱离了红细胞后的血红蛋白是有肾毒性的蛋白，必须经过交联变为合适的分子量的蛋白才可以临床应用，交联血红蛋白有PEG、戊二醛、棉子糖、双阿司匹林等方法，其中戊二醛凭其与蛋白质反应具有活性高、反应快、给合量高、交联性能好，且交联产物性质稳定并可保持蛋白质的精细结构，对酶的活性影响小的特点，成为血红蛋白交联常选择的方法。但戊二醛交联也有其明显的缺点，一是交联反应无特异性，因为血红蛋白表面约有40个赖氨酸侧链氨基以及四个链端氨基可以参与反应，反应较难控制，终产品的分子量分布从32kD到1000kD以上，致使终产品是非均一性的混合物。分子量的控制一直是戊二醛交联血红蛋白的一个难点，过低的分子量稳定性差，容易离解造成肾毒性，而且携氧效率低；过高的分子量会使血液黏度增加，不利于血液的流动，而且会沉积在血管内壁及肝或脾中。体外实验表明要尽量降低未聚合的二聚体的含量，降低大于500kD大分子聚合的含量，已获得安全性和有效性高的产品。同时，使该交联的血红蛋白能够替代红细胞用于器官体外灌注保存。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种交联血红蛋白的制备方法，该方法制得的交联血红蛋白含有较低含量的大分子(大于500kD)和小分子(小于64KD)，将该交联血红蛋白加入到器官灌注液中能够解决现行灌注液因缺少携氧剂而引起器官的酸中毒和溶酶体酶激活不良后果及再灌注时产生过量的自由基损伤细胞的现象，其制备、储存、运输及使用均十分简单方便。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种交联血红蛋白的制备方法，其包括如下步骤：a、稀释脱氧血红蛋白，加入无氧反应器中；b、所述无氧反应器顶部设置雾化器，交联剂通过所述雾化器加入反应器中，发生交联反应；c、加入还原剂终止交联反应,用超滤换液的方式除去未反应的交联剂和终止还原剂,得到交联血红蛋白。其中还原剂可以为硼氢化钠，超滤是使用10Kd-100kD的膜包或中空纤维柱通过切向流的方式纯化交联的血红蛋白。上述交联血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤a中，稀释脱氧血红蛋白浓度到1-3g/dl，在所述血红蛋白中加入巯基化合物，使溶液中血红蛋白与巯基化合物的质量比为5-10:1。上述交联血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤a中，所述巯基化合物为巯基乙胺、谷胱甘肽或N-乙酰-L-半胱氨酸。上述交联血红蛋白的制备方法，其中，其中，所述步骤b中，所述交联剂的添加速度为50-500ml/min。上述交联血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤b中，所述反应器的压力为1.05-1.25bar。上述交联血红蛋白的制备方法，其中，所述反应器中加入的血红蛋白与交联剂的质量比为1000:29-45。本专利技术还提供了一种器官灌注液，该器官灌注液包括上述制备方法制得的交联血红蛋白。上述器官灌注液，其中，所述器官灌注液还包括维生素K1和前列环素。上述器官灌注液，其中，所述器官灌注液包括：上述各成分含量指在1000ml所述器官灌注液中的含量。本专利技术还提供了一种器官灌注液的制备方法，其包括如下步骤：a、按配方比例加入人白蛋白、肝素、8.4％碳酸氢钠、10％葡萄糖酸钙、万古霉素、庆大霉素、10％复方氨基酸注射液、注射用12种复合维生素、维生素K1，蒸馏水定量，过滤除菌，无菌灌装，封口，得到溶液Ⅰ；b、将权利要求1-6中任一项制备方法制得的交联血红蛋白溶液经脱氧、过滤除菌、无菌无氧灌装、热塑封口得到溶液Ⅱ；c、按配方比例提供单独包装的前列环素，得到溶液Ⅲ；d、将溶液Ⅰ、溶液Ⅱ按比例混匀，配合溶液Ⅲ输注，得到器官灌注液。本专利技术的交联血红蛋白的制备方法具有如下有益效果：1、本专利技术的交联血红蛋白的制备方法，采用雾化器加入交联剂，显著改善了交联过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种交联血红蛋白的制备方法，其包括如下步骤：/na、稀释脱氧血红蛋白，加入无氧反应器中；/nb、所述无氧反应器顶部设置雾化器，交联剂通过所述雾化器加入反应器中，发生交联反应；/nc、加入还原剂终止交联反应,用超滤换液的方式除去未反应的交联剂和终止还原剂,得到交联血红蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种交联血红蛋白的制备方法，其包括如下步骤：
a、稀释脱氧血红蛋白，加入无氧反应器中；
b、所述无氧反应器顶部设置雾化器，交联剂通过所述雾化器加入反应器中，发生交联反应；
c、加入还原剂终止交联反应,用超滤换液的方式除去未反应的交联剂和终止还原剂,得到交联血红蛋白。


2.如权利要求1所述的交联血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤a中，稀释脱氧血红蛋白浓度到1-3g/dl，在所述血红蛋白中加入巯基化合物，使溶液中血红蛋白与巯基化合物的质量比为5-10:1。


3.如权利要求2所述的交联血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤a中，所述巯基化合物为巯基乙胺、谷胱甘肽或N-乙酰-L-半胱氨酸。


4.如权利要求1或2所述的交联血红蛋白的制备方法，其中，其中，所述步骤b中，所述交联剂的添加速度为50-500ml/min。


5.如权利要求1所述的交联血红蛋白的制备方法，其中，所述步骤b中，所述反应器的压力为1.05-1.25bar。


6.如权利要求1所述的交联血红蛋白的制备方法，其中，所述反...

【专利技术属性】
技术研发人员：游可为，史国营，孙新宇，陈浩源，
申请(专利权)人：润方北京生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11