一种分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白及牛血红蛋白的新型磁珠的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种可用于分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白、牛血红蛋白的新型磁珠及其制备方法和应用。首先利用共沉淀法制备纳米四氧化三铁磁核，然后在该磁核表面直接修饰上若干种不同的羧基化硅烷偶联剂作为配体，使之可以螯合金属离子。按照本发明专利技术方法制得的磁珠不仅磁性好、性质稳定、易分散，而且还具有合成方法简单、易于控制和实现等优点，通过磁珠表面的金属离子与重组蛋白表面组氨酸残基之间强烈的配位作用稳定结合，能够高选择性、高效率的分离纯化His‑tagged蛋白、牛血红蛋白等目标蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白及牛血红蛋白的新型磁珠的制备方法和应用
本专利技术涉及生物功能材料
，具体涉及一种可用于分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白、牛血红蛋白的新型磁珠及其制备方法和应用。
技术介绍
蛋白质是一类重要的生物大分子，它是一切生命活动的主要承担者和物质基础。对蛋白质的结构功能进行研究并最终实现应用的前提和基础为蛋白质的高效分离纯化。常规的蛋白质分离提取技术通常依赖于蛋白质在溶解性、疏水性、分子大小、表面所带电荷以及特异生物学亲和性上的差异，由此发展出了盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法等粗分离方法。此类方法虽然操作简便、处理量大，但通常分辨率过低，无法有效的分离出目标蛋白。其他蛋白质精细分离技术还有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等，这些方法普遍存在价格昂贵、处理量少、对设备要求较高、难以大规模应用等问题。因此建立一种高选择性、可大规模应用的蛋白质分离技术是当前迫切且极具发展前景的一项任务。基于金属螯合层析技术和功能化修饰磁珠发展起来的金属螯合磁珠是提取分离蛋白质的优良方法，这类磁珠表面修饰的功能化基团通过配位作用与金属离子牢固结合在一起，而重组蛋白表面所带的标签蛋白与金属离子之间的配位作用便于高选择性的提取到目标蛋白。这种方法成本相对较低、操作相对简单，在重组蛋白质的纯化中具有明显的优势。目前已有不少金属螯合磁珠被公开报道，也有不少商业化金属螯合磁珠产品，本专利技术采用新思路用新途径制备了一系列新型磁珠。与以往制备方法相比，本专利技术方法具有成本低、合成路线简单、效率高等显著优势。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种可用于分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白及牛血红蛋白的新型磁珠的制备方法，该方法具体如下：(a)保护气氛下将复合铁盐溶于水中，接着加入氨水，调节溶液pH至碱性并升温进行陈化反应，固液分离得到纳米四氧化三铁磁核，将磁核分散在除氧去离子水中，得到磁核溶液；(b)以A组分和B组分为原料，制备配体溶液；(c)将步骤(a)制得的磁核溶液与步骤(b)制得的配体溶液混合，调节混合溶液的pH至酸性并升温反应，最后固液分离得到磁珠；其中A组分为γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)或N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH900)，B组分为氯乙酸钠；或者A组分为γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)，B组分为亚氨基二乙酸；或者A组分为γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)，B组分为亚氨基二乙酸、环氧氯丙烷的混合物。进一步的，步骤(a)所述复合铁盐为水溶性三价铁盐和水溶性二价铁盐的混合物，两者的质量比为1:1.0-1.4。所述水溶性三价铁盐选自Fe(NH4)2·(SO4)2或其水合物，所述水溶性二价铁盐选自FeCl3或其水合物。进一步的，步骤(a)具体过程如下：首先将去离子水煮沸后密封自然冷却，以便尽可能除去其中的氧；接着在氮气保护下向去离子水中加入复合铁盐使其充分溶解，所得混合物加热至50-70℃后以200-300r/min的速率搅拌20-40min，然后加入适量氨水调节溶液的pH至10-12，所得混合物继续加热至80-90℃，保温陈化0.5-2h，磁吸附分离后用乙醇和除氧去离子水洗涤所得固体至中性，再加入到除氧去离子水中得到磁核溶液。进一步的，步骤(b)中配体溶液的制备方法具体如下：①冰浴条件下向去离子水中滴加KH550，再加入氯乙酸钠，升温并调节溶液的pH至碱性，反应一段时间后得到配体溶液A；或者②冰浴条件下向去离子水中滴加KH900，再加入氯乙酸钠，升温并调节溶液pH至碱性，反应一段时间后得到配体溶液B；或者③冰浴条件下将亚氨基二乙酸溶解在去离子水中，调节溶液pH至碱性后滴加KH560，所得混合液转移至水浴中升温反应一段时间后再次转移至冰浴中，再次滴加KH560并水浴升温反应，最终得到配体溶液C；或者④将亚氨基二乙酸溶于去离子水中并用氢氧化钠调节溶液pH至碱性，接着加入环氧氯丙烷并水浴升温反应，所得混合物转移至冰浴中并滴加KH550，最后加入氢氧化钠调节溶液pH至碱性并升温反应，得到配体溶液D。进一步的，步骤(b)中混合溶液升温至40-90℃，pH调节至8-12(所使用的pH调节剂为NaOH水溶液或碳酸钠水溶液)，总的反应时间为4-8h。进一步的，步骤(b)中制备配体溶液A所需KH550、氯乙酸钠的摩尔比为1:2-4，制备配体溶液B所需KH900、氯乙酸钠的摩尔比为1:2-4，制备配体溶液C所需KH560、亚氨基二乙酸的用量比为3mL:3.5-4.5g，制备配体溶液D所需KH550、亚氨基二乙酸、环氧氯丙烷的用量比为1.0-2.0mL:2.0g:1.0-2.0mL。进一步的，步骤(c)中磁核溶液的浓度为5-15g/L，其与配体溶液混合时的体积比为1:1.1-1.4。进一步的，步骤(c)中磁核溶液加入到配体溶液后先超声10-30min，接着用盐酸溶液调节体系pH至3-6，然后升温至80-100℃搅拌反应1-3h，最后磁吸附分离并用乙醇、去离子水反复洗涤所得固体。进一步的，所述纳米四氧化三铁磁核的粒径为(50-500)nm。本专利技术的另一目的在提供一种按照上述方法制备得到的磁珠。本专利技术的第三重目的在于制得的磁珠在分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白及牛血红蛋白方面的应用。本专利技术在现有金属螯合磁珠的制备基础上进行了改进，进一步提高了制备和提取效率，改进后的方法以超顺磁性的纳米四氧化三铁为内核，在其表面直接修饰上硅烷偶联剂作为连接剂，在修饰过程中硅烷偶联剂会少量水解并因此包裹于磁核表面，使得磁核中金属离子产生的非特异性吸附降低，同时也起到保护磁核的作用，提高了磁核的抗性和耐酸碱性，保护了微粒的磁响应性有利于磁珠的重复使用。此外本专利技术采用四种配体进行修饰，延长了金属离子与磁核的距离，从而削弱了大部分的其他吸附作用，使得金属离子与目标蛋白间的配位效应几乎成为唯一的作用力，提高了磁珠对标签蛋白和牛血红蛋白的吸附特异性，进而提升了目标蛋白的提取效率。配体中某些组成可与金属离子(Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+)螯合，而这些金属离子与组氨酸标签蛋白等有很强的结合力，使得本专利技术的金属螯合磁性微珠具有较高的选择性分离蛋白的能力。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在以下几个方面：对现有金属螯合磁珠的制备方法进行了改良。传统金属螯合磁珠大多逐步向外合成，磁核外依次包裹二氧化硅、硅烷偶联剂、亚氨基二乙酸、环氧氯丙烷等物质，而本专利技术提供的新型磁珠同时制备纳米四氧化三铁磁核和配体，再直接将配体连接到磁核上，省去了传统制备方式中修饰二氧化硅层的步骤，简化了步骤节约了时间降低了制备成本。另外，用液液反应取代了传统的固液反应，大大提高了磁珠的制备和提取效率。附图说明图1为本专利技术磁珠制备工艺流程图。图2为本专利技术实施例1制得的IDA磁珠、实施例5制备的镍-IDA磁珠分离纯化分散蛋白B的电泳图，以及两种磁珠经盐酸处理后分离纯化分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可用于分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白及牛血红蛋白的新型磁珠的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：/n(a)保护气氛下将复合铁盐溶于水中，接着加入氨水，调节溶液pH至碱性并升温进行陈化反应，固液分离得到纳米四氧化三铁磁核，将磁核分散在除氧去离子水中，得到磁核溶液；/n(b)以A组分和B组分为原料，制备配体溶液；/n(c)将步骤(a)制得的磁核溶液与步骤(b)制得的配体溶液混合，调节混合溶液的pH至酸性并升温反应，最后固液分离得到磁珠；/n其中A组分为KH550或KH900，B组分为氯乙酸钠；或者A组分为KH560，B组分为亚氨基二乙酸；或者A组分为KH550，B组分为亚氨基二乙酸、环氧氯丙烷的混合物。/n

【技术特征摘要】
1.一种可用于分离、纯化和固定化组氨酸标签蛋白及牛血红蛋白的新型磁珠的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(a)保护气氛下将复合铁盐溶于水中，接着加入氨水，调节溶液pH至碱性并升温进行陈化反应，固液分离得到纳米四氧化三铁磁核，将磁核分散在除氧去离子水中，得到磁核溶液；
(b)以A组分和B组分为原料，制备配体溶液；
(c)将步骤(a)制得的磁核溶液与步骤(b)制得的配体溶液混合，调节混合溶液的pH至酸性并升温反应，最后固液分离得到磁珠；
其中A组分为KH550或KH900，B组分为氯乙酸钠；或者A组分为KH560，B组分为亚氨基二乙酸；或者A组分为KH550，B组分为亚氨基二乙酸、环氧氯丙烷的混合物。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)所述复合铁盐为水溶性三价铁盐和水溶性二价铁盐的混合物，两者质量比为1:1.0-1.4，所述水溶性三价铁盐选自Fe(NH4)2·(SO4)2或其水合物，所述水溶性二价铁盐选自FeCl3或其水合物。


3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(a)具体过程如下：首先将去离子水煮沸除氧后密封使其自然冷却，接着在氮气保护下向除氧去离子水中加入复合铁盐，所得混合物加热至50-70℃后以200-300r/min的速率搅拌20-40min，然后加入氨水调节溶液的pH至10-12，继续加热至80-90℃并保温陈化0.5-2h，磁吸附分离后用乙醇和除氧去离子水洗涤所得固体至中性，再加入到除氧去离子水中得到磁核溶液。


4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(b)中配体溶液的制备方法具体如下：①冰浴条件下向去离子水中滴加KH550，再加入氯乙酸钠，升温至40-90℃并调节溶液的pH至8-12，反应4-8h后得到配体溶液A；或者②冰浴条件下向去离子水中滴加KH900，再加入氯乙酸钠，升温至40-90℃并调节溶液p...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙恩杰，王宇，胡亚悦，曾凯，李呈祥，谢浩，
申请(专利权)人：武汉理工大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42