一种基于柠檬酸发酵废弃物的ε-聚赖氨酸生物合成方法技术

本发明专利技术公开了一种基于柠檬酸发酵废弃物的ε

【技术实现步骤摘要】
一种基于柠檬酸发酵废弃物的
ε
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聚赖氨酸生物合成方法


[0001]本专利技术涉及一种ε
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聚赖氨酸的合成方法，具体涉及一种基于柠檬酸发酵废弃物的ε
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聚赖氨酸生物合成方法，是对柠檬酸发酵废水、废渣中的微生物诱导物进行提取，并在分批及补料分批发酵中进行提取物的外源添加来强化ε
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聚赖氨酸合成的方法，属于工业生物


技术介绍

[0002]柠檬酸，又名枸橼酸，是一种重要食品添加剂，目前主要通过黑曲霉液态发酵薯类、玉米类底物合成。目前，国内柠檬酸发酵产量约为14％左右，而余下部分由大量有机发酵废水和废渣组成。研究显示，1吨柠檬酸将产生8
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15m3发酵性废水，以及2
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4吨发酵废渣。我国是全球柠檬酸的最大生产国之一，每年产生的废水废渣量更是巨大。“如何对此类废弃物进行资源化利用”成为了重要课题。
[0003]针对柠檬酸发酵废水问题，毛忠贵团队开发出“柠檬酸
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沼气双发酵偶联系统”，对柠檬酸发酵废水进行厌氧发酵并以产物沼气发电，处理过后的废水再回用柠檬酸发酵配料中，实现了废水的资源化利用。针对发酵废渣(废菌体)问题，部分企业将其作为氨基葡萄糖盐酸盐提取的原料，而大部分企业将其与麸皮、秸秆等农业副产物混合制备动物饲料，或是以其为底物固态发酵制备蛋白饲料。尽管如此，目前在柠檬酸发酵废液、废渣资源化方面的技术手段依然稀缺，尤其缺少利用此类废弃物合成高值产物的技术，这直接影响本领域的进一步发展。
[0004]ε
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聚赖氨酸是一种主要由链霉菌属合成的天然同型阳离子聚合物，其由25
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35个赖氨酸残基经α
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羧基与ε
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氨基在聚赖氨酸合成酶的催化下脱水缩合而成。ε
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聚赖氨酸抑菌能力强，抑菌谱广，其对大多数革兰氏阳性细菌、阴性细菌具有显著的抑制能力，同时还可抑制酵母和霉菌的生长。此外，其不易被人体吸收，少量吸收后也能够被降解为无毒的赖氨酸，其由此被美国FDA认定为GRAS化合物(Generally Recognized as Safe)，并在2014年被我国卫计委批准作为食品防腐剂而使用，具有较大的社会需求和经济价值。当前，ε
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聚赖氨酸的市场价为1200
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1500元/kg，是一种高值产品。
[0005]专利技术人前期研究发现，黑曲霉胞内以及胞外分泌的一些产物能够大幅促进ε
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聚赖氨酸生物合成。基于此发现，专利技术人开发出一种基于外源添加柠檬酸发酵废水提取物、废渣提取物，进而促进ε
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聚赖氨酸合成的生产工艺。无论是添加的柠檬酸发酵废水提取物，还是废渣提取物，均能够(1)在分批发酵中大幅促进菌体生长以及ε
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聚赖氨酸合成，缩减发酵时间，提高生长效率；(2)在补料分批发酵中大幅促进ε
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聚赖氨酸合成。因此，本专利技术在柠檬酸发酵废弃物资源化，以及ε
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聚赖氨酸工业生产中具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0006]为促进ε
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聚赖氨酸合成，同时实现柠檬酸发酵废液、废渣的资源化，本专利技术提供了一种基于柠檬酸发酵废弃物的ε
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聚赖氨酸生物合成方法。本专利技术采用有机溶剂对柠檬酸发
酵废水、废渣进行提取，并将其添加到ε
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聚赖氨酸分批发酵以及补料分批发酵中，进而促进了ε
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聚赖氨酸的合成。
[0007]为实现本专利技术的目的，本专利技术中柠檬酸发酵采用的碳源为葡萄糖、蔗糖、糖蜜、木薯粉、玉米淀粉。
[0008]本专利技术的反应器包括250mL三角瓶、5L液态发酵罐两种。
[0009]柠檬酸发酵废水提取物添加ε
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聚赖氨酸发酵实验相关条件优化、柠檬酸发酵废渣提取物添加ε
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聚赖氨酸发酵实验相关条件优化均在250mL三角瓶中完成，柠檬酸发酵种子培养、ε
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聚赖氨酸发酵种子培养均在500mL三角瓶中进行，柠檬酸发酵废水提取物添加ε
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聚赖氨酸分批发酵、补料分批发酵均在5L发酵罐中进行。
[0010]本专利技术基于柠檬酸发酵废弃物的ε
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聚赖氨酸生物合成方法，包括如下步骤：
[0011]步骤1：柠檬酸发酵种子培养
[0012]将黑曲霉孢子接种于PDA固体培养基中，在37℃培养箱培养5天直至长出黑色孢子。用接种环接种2环孢子(约7
×
107个)进入柠檬酸发酵种子培养基中，于37℃、160rpm摇床中培养20
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22h。
[0013]步骤2：柠檬酸发酵
[0014]将步骤1获得的成熟种子以15％接种量接入装有3L柠檬酸发酵培养基的5L发酵罐中(上海保兴)进行发酵，发酵72h；发酵罐温度、通气量以及搅拌转速分别控制在37℃、2vvm和600rpm直至发酵结束。
[0015]步骤3：柠檬酸发酵废水、废渣提取物的制备
[0016]步骤2获得的发酵液采用4层纱布过滤，获得滤液及滤渣；滤液及滤渣分别采用以下方法进行处理，获得柠檬酸发酵废水提取物以及废渣提取物：
[0017]3a、滤液采用当前通用的钙盐法进行柠檬酸提取，即添加过量轻质碳酸钙于滤液中，充分搅拌直至体系pH接近6.5
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6.8，此后3000rpm离心10min，上清液中加入1/5体积的正丁醇，充分搅拌，离心分层后，取丁醇相，剩余萃余液再加入1/5体积正丁醇，重复如上步骤萃取2次；萃取液合并后旋转蒸发，获得纯溶剂并浓缩提取物；浓缩液与乙醇溶液混合(乙醇终浓度75％)，静置2h后4000rpm离心10min，上清液置于90℃干燥箱中干燥，此后用去离子水按照发酵废水和提取水比为5：1对该提取物进行复溶，提取液115℃高温高压灭菌后于4℃保存备用，即为柠檬酸发酵废水提取物；
[0018]3b、滤渣用水洗2次后，加入终浓度为75％的乙醇，浸泡3h后于研钵中研磨，浸泡8
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12h，3000rpm离心10min，上清液置于旋转蒸发仪中蒸发回收溶剂并获得浓缩液，浓缩液置于90℃干燥箱中干燥，此后用去离子水按照渣水比1：3对该提取物进行复溶，提取液115℃高温高压灭菌后置于4℃保存备用，即为柠檬酸发酵废渣提取物；
[0019]步骤4：ε
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聚赖氨酸发酵种子培养
[0020]将小白链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于30℃恒温培养箱中培养10天，直至长出孢子；用接种环挑取2环孢子(约7
×
107个)置于装液量80mL的500mLM3G培养基摇瓶中，于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天，获得可用于ε
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聚赖氨酸发酵的成熟小白链霉菌种子液；
[0021]步骤5：添加柠檬酸发酵废水提取物的ε<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于柠檬酸发酵废弃物的ε
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聚赖氨酸生物合成方法，其特征在于：采用有机溶剂对柠檬酸发酵废水、废渣进行提取，并将其添加到ε
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聚赖氨酸发酵过程中，进而促进ε
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聚赖氨酸的合成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：柠檬酸发酵种子培养将黑曲霉孢子接种于PDA固体培养基中，在37℃培养箱培养5天直至长出黑色孢子，用接种环接种2环孢子进入柠檬酸发酵种子培养基中，于37℃、160rpm摇床中培养20
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22h；步骤2：柠檬酸发酵将步骤1获得的成熟种子以15％接种量接入装有3L柠檬酸发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵，发酵72h；步骤3：柠檬酸发酵废水、废渣提取物的制备步骤2获得的发酵液采用4层纱布过滤，获得滤液及滤渣；滤液及滤渣分别采用以下方法进行处理，获得柠檬酸发酵废水提取物以及废渣提取物：3a、滤液采用常规钙盐法进行柠檬酸提取，即添加过量轻质碳酸钙于滤液中，充分搅拌直至体系pH接近6.5
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6.8，离心后向上清液中加入正丁醇，充分搅拌，离心分层后，取丁醇相，剩余萃余液再加入正丁醇，重复如上步骤萃取2次；萃取液合并后旋转蒸发，获得纯溶剂并浓缩提取物；浓缩液与乙醇溶液混合，静置2h后离心，上清液置于90℃干燥箱中干燥，此后用去离子水对提取物进行复溶，提取液115℃高温高压灭菌后于4℃保存备用，即为柠檬酸发酵废水提取物；3b、滤渣水洗后加入乙醇，浸泡3h后于研钵中研磨，浸泡8
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12h，离心，上清液旋蒸回收溶剂并获得浓缩液，浓缩液置于90℃干燥箱中干燥，此后用去离子水对提取物进行复溶，提取液115℃高温高压灭菌后置于4℃保存备用，即为柠檬酸发酵废渣提取物；步骤4：ε
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聚赖氨酸发酵种子培养将小白链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于30℃恒温培养箱中培养10天，直至长出孢子；用接种环挑取2环孢子置于装液量80mL的500mLM3G培养基摇瓶中，于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天，获得可用于ε
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聚赖氨酸发酵的成熟小白链霉菌种子液；步骤5：ε
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聚赖氨酸发酵在ε
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【专利技术属性】
技术研发人员：曾昕，李峰，曾化伟，信丙越，徐大勇，张标，李珊珊，
申请(专利权)人：淮北师范大学，
类型：发明
国别省市：