一种茶多酚类化合物在制备抗血栓药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种茶多酚类化合物在抑制蛋白质二硫键异构酶中的应用所述茶多酚类化合物包括水飞蓟宾、桑色素。本发明专利技术首次发现水飞蓟宾和桑色素可结合蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase,PDI），具有PDI抑制活性，故其可用于开发制备预防血栓性疾病的药物，并具有广泛的应用前景。并具有广泛的应用前景。并具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
b'x Domain. J Biol Chem. 2015 Sep 25;290(39):23543
‑
52和Jasuja et al., Protein disulfide isomerase inhibitors constitute a new class of antithrombotic agents, JCI, 2012 Jun;122(6):2104
‑
13.)。因此，PDI可作为一个新型的抗血栓治疗靶点。

技术实现思路

[0005]一种茶多酚类化合物在抑制蛋白质二硫键异构酶中的应用，所述茶多酚类化合物包括水飞蓟宾、桑色素。
[0006]本专利技术利用水飞蓟宾和桑色素具有PDI抑制活性的特性，提出一种水飞蓟宾和桑色素在制备抗血栓药物中的应用，从而为临床抗血栓治疗提供两种安全有效的小分子化合物。
[0007]本专利技术利用上述茶多酚类化合物抑制蛋白质二硫键异构酶活性，抑制血管损伤部位的血小板聚集和纤维蛋白生成，从而阻止血栓形成。
[0008]所述抗血栓药物是以水飞蓟宾、桑色素或其分子结构药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、晶体形式或非对映异构体作为药物活性成分，制成的片剂、胶囊、颗粒剂、口服液或注射剂。
[0009]本专利技术所用的水飞蓟宾，其英文名称Silibinin，分子式为C
25
H
22
O
10
，分子量为482.44，其化学结构如下：。
[0010]本专利技术所用的桑色素，其英文名称Morin，分子式为C
15
H
10
O7，分子量为302.24，其化学结构如下：。
[0011]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种水飞蓟宾和桑色素在制备抗血栓药物中的应用，其是利用水飞蓟宾和桑色素具有PDI抑制活性的特性，而以水飞蓟宾和桑色素或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、晶体形式或非对映异构体作为药物活性成分，制成的任何一种药学上可接受的剂型，包括片剂、胶囊、颗粒剂、口服液或注射剂。
[0012]通过对水飞蓟宾和桑色素分别进行体外PDI结合测定，其IC50分别为93.8 μM和54.4 μM；在酶抑制活性实验发现，不同浓度的化合物对PDI具有较好的抑制活性；电流诱导颈动脉血栓形成动物模型实验结果显示，水飞蓟宾或桑色素能显著改善小鼠血栓的形成；出血风险评价实验结果显示，水飞蓟宾或桑色素给药并不延长小鼠尾出血时间，未影响小鼠的整体凝血。因此，水飞蓟宾和桑色素或其可药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、晶体
形式或非对映异构体可以作为PDI抑制剂用于制备抗血栓药物。
[0013]由于上述技术方案的运用，本专利技术的有益效果在于：PDI酶在血栓形成的初始阶段发挥重要作用，可作为抗血栓治疗的新靶点，且抑制PDI酶并不影响正常凝血功能。本专利技术发现水飞蓟宾和桑色素具有PDI酶抑制剂的功能，可抑制体内血栓生成，不引发出血风险。体外试验证明，水飞蓟宾和桑色素可以结合PDI、抑制PDI的还原活性，为PDI的抑制剂；体内试验证明，这两种PDI抑制剂可以有效延缓小鼠颈总动脉在直流电刺激下的栓塞时间，发挥抗血栓作用，且不会导致出血并发症。因此，水飞蓟宾和桑色素可以作为PDI 的抑制剂，应用于制备抗血栓治疗药物。
附图说明
[0014]图1为水飞蓟宾对PDI酶的体外结合及半数抑制浓度（IC
50
）。
[0015]图2为桑色素对PDI酶的体外结合及半数抑制浓度（IC
50
）。
[0016]图3为水飞蓟宾对PDI酶活性的浓度依赖性抑制。
[0017]图4为桑色素对PDI酶活性的浓度依赖性抑制。
[0018]图5为水飞蓟宾和桑色素对电流诱导颈动脉血栓形成时间的对比情况图。
[0019]图6为水飞蓟宾和桑色素导致出血风险的情况图。
具体实施方式
[0020]为更好地理解本专利技术的内容，以下结合说明书附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术要求保护的范围不局限于实施例表述的范围。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0021]实施例1：水飞蓟宾或桑色素对PDI酶的体外结合实验方法：PDI由实验专利技术单位纯化，参见文献X Wang, G Xue, M Song, P Xu, D Chen, C Yuan, L Lin, R Flaumenhaft, J Li*, M Huang* (2018), Molecular basis of rutin inhibition of protein disulfide isomerase (PDI) by combined in silico and experimental methods, RSC Advances 8 (33), 18480
‑
18491，经SDS
‑
PAGE检测其纯度大于95%。分别取10微升不同浓度溶解于DMSO的水飞蓟宾或桑色素加入96孔板中，每孔加入90微升含PDI的缓冲溶液（50 mM Tris
‑
HCl，150 mM NaCl， pH 7.4），室温孵育10分钟后，放入酶标仪（Spectra Max i3x, Molecular Devices, U.S.）中在278 nm处激发，检测300
‑
500 nm的发射，2 nm/read进行检测。每个测试至少重复3次，取平均值。数据处理采用Graphpad Prism 8软件，以不同小分子化合物浓度对应的荧光峰值进行非线性拟合，计算IC
50
。
[0022]实验结果：如图1和图2所示，本专利技术采用一种基于PDI内在荧光减弱的直接结合试验，测定小分子化合物与PDI的结合力。当在278 nm处激发时，PDI在350 nm处发射荧光，当结合水飞蓟宾或桑色素时，荧光值减弱，且呈现浓度依赖性，通过拟合得到水飞蓟宾和桑色素的IC
50
分别为93 μM和54 μM。此外，结合水飞蓟宾使PDI的发射峰红移，结合桑色素使PDI的发射峰蓝移。
[0023]实施例2：水飞蓟宾或桑色素抑制PDI酶还原活性实验方法：通过硫醇异构酶在DTT存在下催化胰岛素还原反应来测定PDI还原酶活性。还原胰岛素链的聚集在650 nm处有明显吸收。反应体系为含有500 μM胰岛素，1.5 μM PDI的缓冲溶液（50 mM Tris
‑
HCl，150 mM NaCl，1 mM DTT，1 mM EDTA，pH 7.4），总体积为100微升。分别取2微升不同浓度溶解于DMSO的水飞蓟宾或桑色素加入96孔板中，每孔加入38微升缓冲溶液，再加入10微升PDI溶液，于室温孵育10分钟后，加入50微升胰岛素溶液，立即放入酶标仪（Spectra Max i3x, Molecular Devices, U.S.）中，在37℃条件本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种茶多酚类化合物在抑制蛋白质二硫键异构酶中的应用，其特征在于，所述茶多酚类化合物包括水飞蓟宾、桑色素。2.一种抗血栓药物，其特征在于，利用权利要求1所述茶多酚类化合物抑制蛋白质二硫键异构酶活性，抑制血管损伤部位的血小板聚集和纤维蛋白生...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄明东，陈丹，袁彩，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：