基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗，所述疫苗包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包含融合蛋白，其中所述融合蛋白包含冠状病毒科的病毒的S蛋白的至少一个免疫原性部分以及与所述S蛋白的至少一个免疫原性部分连接的自组装的、单体亚基的至少一部分，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示所述S蛋白的至少一个免疫原性部分。本发明专利技术的冠状病毒疫苗可用于预防和/或治疗冠状病毒感染。和/或治疗冠状病毒感染。

Nanoparticle based coronavirus vaccine

【技术实现步骤摘要】
基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗。

技术介绍

[0002]新型冠状肺炎病毒(SARS
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CoV
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2)导致的新冠状病毒肺炎(COVID
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19)是继SARS之后对人类健康具有重大威胁的突发性疾病。
[0003]2020年1月7日，中科院武汉病毒所检测出新型冠状病毒并获得该病毒的全基因组序列。2月3日，其通过对比新型冠状病毒和实验室早期检测的冠状病毒的部分序列，发现该新型冠状病毒与蝙蝠样本的一株冠状病毒基因序列一致性高达96％。SARS
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CoV
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2能通过与SARS
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CoV相同的方式，即与人ACE2细胞受体结合的方式入侵细胞。
[0004]SARS
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CoV
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2是一种包膜的单链正义RNA病毒，其刺突蛋白(S)从球形病毒体表面突出，并介导病毒进入宿主细胞。S蛋白包含两个功能性亚基S1和S2。其中，S1亚基主要由N端结构域(N
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terminal domain，NTD)和C端结构域(CTD)组成。CTD直接与细胞受体人类血管紧张素转化酶2(angiotensin
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converting enzyme 2，ACE2)结合，并起受体结合域(receptor
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binding domain，RBD)的作用。RBD由核心结构(core structure)和受体结合基序(receptor
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binding motif，RBM)组成，负责直接与ACE2受体结合。
[0005]目前，全球众多研究机构和生物医药公司加入COVID
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19新疫苗的开发中，且疫苗开发的类别涉及多个类目，既包括减毒疫苗、灭活病毒疫苗、重组蛋白疫苗等传统方式的疫苗类型，还包括DC疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗以及病毒载体疫苗的新型疫苗类型。核酸疫苗目前的安全性和稳定性还有待验证，而减毒和灭活疫苗的安全性则一直是一个问题。在这些众多的研究项目中，未见以纳米颗粒的形式来制备COVID
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19疫苗的相关研究项目。
[0006]最近NanoViricides在新闻报道中宣布正在开发一种COVID
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19疗法，其依赖于他们特定的Versatile Platform技术平台，即在纳米胶束表面展示能够被病毒S蛋白识别的受体
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配体复合物，而后使得纳米颗粒与病毒脂质膜融合，从而达到杀灭病毒的目的。NanoViricides的这种技术需要先筛选能与病毒结合受体蛋白(如ACE
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2受体)结合的配体，而后形成配体
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受体蛋白复合物，开发难度大，制备程序复杂，且其无法在体内产生抗体，无法达到预防疫苗的效果，仅作为治疗用途。
[0007]铁蛋白具有均一、稳定的笼状结构。铁蛋白独特的笼状结构也使得其可以病毒样纳米颗粒的形式，作为有潜力的候选疫苗类型。而到目前为止，采用铁蛋白作为冠状病毒的纳米疫苗未见报道。因此，本领域仍旧需要发展新的、更有效、安全和稳定的疫苗形式，来预防和/或治疗包括新型冠状肺炎在内的疾病的发生。

技术实现思路

[0008]本专利技术通过分析冠状病毒科，尤其是新型冠状病毒SARS
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CoV
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2的S蛋白与其受体ACE2的结合位点，确定S蛋白的受体结合基序RBM。本专利技术旨在构建RBM与自组装的、单体亚基的融合蛋白，开发出用于新型冠状病毒感染的预防和/或治疗药物。
[0009]本专利技术对铁蛋白单体亚基序列进行Cys点突变，能够减少聚集体生成、提高蛋白可溶性表达和复性效率。
[0010]本专利技术提供了铁蛋白的单体亚基的截短突变体，使得RBM连接于铁蛋白C末端时有更好的伸展空间。
[0011]具体来说，本专利技术提出了如下技术方案：
[0012]在一方面，本专利技术提供了一种包含融合蛋白的纳米颗粒。
[0013]在一方面，本专利技术提供了一种用于生产前述纳米颗粒的方法。
[0014]在一方面，本专利技术提供了一种疫苗组合物。
[0015]在一方面，本专利技术提供了一种ACE
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2受体拮抗剂。
[0016]在一方面，本专利技术提供了一种生成针对冠状病毒科的病毒的疫苗的方法。
[0017]在一方面，本专利技术提供了前述纳米颗粒、疫苗组合物或ACE
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2拮抗剂、疫苗在制备药物中的用途。
[0018]在一方面，本专利技术提供了一种融合蛋白。
[0019]在一方面，本专利技术提供了一种核酸分子。
[0020]在一方面，本专利技术提供了一种表达构建体。
[0021]在一方面，本专利技术提供了一种重组细胞。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0023](1)本专利技术提供的基于铁蛋白的冠状病毒疫苗通过将冠状病毒S蛋白的受体结合基序RBM负载于铁蛋白纳米颗粒的外表面，来模拟冠状病毒的球状结构，与单纯的S蛋白制备抗原相比，能诱发强体液免疫反应及细胞免疫反应，可以预防由冠状病毒引起的感染，具有很好的广谱免疫效果；
[0024](2)本专利技术用大肠杆菌表达系统获得的融合蛋白，能够简单、高产量的自组装形成具有结合活性的笼状蛋白，制备方法简单，易操作，具有高成药价值和产业化价值。
[0025](3)本专利技术在一些技术方案中，将野生型铁蛋白中的Cys突变，避免了铁蛋白纳米颗粒之间形成二硫键，从而降低了聚集体的生成，同时也使得纳米颗粒蛋白以包涵体形式表达后，复性工艺简单，复性成功率提高，同时也增加了蛋白的可溶性。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术的技术方案，下面对所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0027]图1为pET
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22b(+)质粒图谱。
[0028]图2为pBAD质粒图谱。
[0029]图3为重组质粒图谱示意图。
[0030]图4为重组表达质粒双酶切电泳图。
[0031]图5示出了重组菌株(质粒为pET
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22b(+))在LB平板(Amp+)上的生长情况。
[0032]图6示出了SDS
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PAGE检测结果。
[0033]图7
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1示出了目的蛋白复性液SEC
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HPLC的检测结果。
[0034]图7
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2示出了HFn SEC
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HPLC检测图谱。
[0035]图8示出了RBM
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HFn的透射电镜结果。
[0036]图9示出了RB本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含融合蛋白的纳米颗粒，其中所述融合蛋白包含冠状病毒科的病毒的S蛋白的至少一个免疫原性部分以及与所述S蛋白的至少一个免疫原性部分连接的自组装的、单体亚基的至少一部分，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示所述S蛋白的至少一个免疫原性部分。2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述冠状病毒科的病毒选自新型冠状肺炎病毒(SARS
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CoV
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2)、SARS
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CoV、MERS
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Cov、229E、NL63、OC43和HKU1。3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其中所述S蛋白的至少一个免疫原性部分衍生自S蛋白受体结合结构域；优选地，所述S蛋白的至少一个免疫原性部分为S蛋白受体结合基序；优选地，所述S蛋白受体结合基序包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述S蛋白受体结合基序的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1
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3任一项所述的纳米颗粒，其中所述单体亚基选自下组：铁蛋白单体亚基、单体encapsulin蛋白、单体03
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33蛋白、单体硫加氧酶还原酶(SOR)蛋白、单体2,4
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二氧四氢蝶啶合酶(lumazine synthase)(LS)蛋白、单体丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)蛋白、单体氢硫辛酰胺乙酰转移酶(E2)蛋白以及甲病毒(如基孔肯雅病毒)的包膜(Env)蛋白；优选地，所述铁蛋白单体亚基是来源于哺乳动物来源的铁蛋白、两栖类动物来源的铁蛋白、细菌来源的铁蛋白或植物来源的铁蛋白中的任意一种或至少两种组合的铁蛋白单体亚基，优选为哺乳动物来源或细菌来源的铁蛋白单体亚基；优选地，所述哺乳动物来源的铁蛋白包括人源性铁蛋白、鼠源性铁蛋白或马脾脏铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述细菌来源的铁蛋白包括幽门螺杆菌铁蛋白、大肠杆菌铁蛋白或激烈火球菌铁蛋白；优选地，所述铁蛋白的来源包括天然提取产物、人工合成产物或基因工程技术产物中的任一种或至少两种的组合；优选地，所述铁蛋白单体亚基包括突变氨基酸序列；优选地，所述突变氨基酸为半胱氨酸(Cys)；更优选地，所述半胱氨酸突变为谷氨酸(Glu)或丙氨酸(Ala)；优选地，所述铁蛋白单体亚基是截短突变体；任选地，所述截短突变体是重链铁蛋白单体亚基C端的α
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螺旋截短突变体；任选地，所述截短突变体是轻链铁蛋白单体亚基C端的ε螺旋截短突变体；任选地，所述截短突变体是重链或轻链铁蛋白单体亚基N端的截短突变体。5.根据权利要求4所述的纳米颗粒，其包含至少一个所述的铁蛋白单体亚基，优选地，所述铁蛋白单体亚基选自重链铁蛋白单体亚基或轻链铁蛋白单体亚基；优选地，所述重链铁蛋白单体亚基和/或轻链铁蛋白单体亚基形成纳米颗粒，更优选地，所述纳米颗粒包含24个铁蛋白单体亚基，其中重链铁蛋白单体亚基与轻链铁蛋白单体亚基的比例为0:24
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24:0；优选地，所述重链铁蛋白单体亚基是人重链铁蛋白单体亚基；优选地，所述轻链铁蛋白单体亚基是人轻链铁蛋白单体亚基；优选地，所述重链铁蛋白单体亚基包含与SEQ ID NO.2、3、4或5所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述重链
铁蛋白亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、3、4或5所示；优选地，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO.6、7、8或9所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯天一，姚德惠，劳芳，张泽译，丁凤姣，王晓飞，刘岩，王闯，成健伟，欧阳芳幸，
申请(专利权)人：昆山新蕴达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：