一种抗PD-1抗体的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种抗PD-1抗体的制备方法，该方法适用于抗PD-1抗体的大规模生产。该方法所制备的抗PD-1抗体不具有糖基化，不易产生免疫原性，避免患者使用后产生不良反应；同时该方法所提供的抗PD-1抗体的纯化方法，解决了在抗体生产过程中容易产生聚体的技术问题。抗体生产过程中容易产生聚体的技术问题。

【技术实现步骤摘要】
一种抗PD-1抗体的制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体地本专利技术涉及一种抗PD-1抗体的制备方法，更具体地，本专利技术公开了一种不含糖基化的抗PD-1抗体的制备方法。

技术介绍

[0002]程序性细胞死亡蛋白1（PD-1： Programmed Cell Death Protein 1，也称为CD279）是表达于活化的T细胞和前B细胞（pro-B cells）上的一种细胞表面受体，是一种免疫检查点蛋白，对免疫系统有负调控作用，通过抑制T细胞炎性活动促进自身耐受，更具体而言，PD-1通过促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡和降低调节性T细胞的凋亡的双重机制防止自身免疫的发生，但也可以阻止免疫系统杀死癌细胞。
[0003]癌细胞的“免疫逃逸”被认为是肿瘤发生、发展和抗药的主要机制。肿瘤可通过直接或间接抑制T细胞的信号来保护自己躲过免疫系统的清除。肿瘤的免疫检查点疗法（immune chenkpoint therapy）是一类通过共抑制或共刺激信号等一系列途径调节T细胞活性来提高抗肿瘤免疫应答的治疗方法。
[0004]PD-1可与2种配体结合（B7家族成员PD-L1和PD-L2）。在小鼠上，PD-L1广泛表达于心、肺、胸腺、脾、肾等多种器官上，以及几乎所有的小鼠肿瘤细胞系，并在多种人类肿瘤细胞上高表达；而PD-L2的表达较为局限，主要是树突状细胞和少数肿瘤细胞系。因此，PD-1及其配体PD-L1成为抗肿瘤免疫治疗的靶点。
[0005]程序性细胞死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）及其配体（PD-L1）抑制剂，是免疫检查点疗法的主要药物，其应答之广度、深度、和持久性均十分罕见，是近年来肿瘤免疫疗法研究的热点。目前已上市的纳武单抗Opdivo（nivolumab）和帕博利珠单抗Keytruda（pembrolizumab）属于PD-1抑制剂，主要用于黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、微卫星高不稳定性癌等恶性肿瘤的治疗。
[0006]PD-1抑制剂（抗PD-1抗体）是一类阻断PD-1的药物，激活免疫系统攻击肿瘤，并用于治疗某些类型的癌症。
[0007]然而抗体药物在取得良好治疗效果的同时，也可能会引发不同程度的过敏反应和抗抗体反应，即人体对外源免疫球蛋白的免疫反应。抗体药物作为外源性蛋白，不可避免地会激活机体自身的免疫反应，诱导产生抗药物抗体，从而严重影响其安全性和有效性，生物药物的糖基化修饰对其结构和功能均有较大影响，进而影响药物的免疫原性。
[0008]糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。蛋白质分子表面的糖链可对蛋白质分子的结构和功能产生深远的影响，糖基化作为重要的翻译后加工过程，对蛋白质的正确折叠、定位、免疫原性以及生物学活性有很大的影响。 单克隆抗体mAb 的糖基化聚糖结构与抗体效应功能之间密切相关，糖基化作用还会影响单克隆抗体mAb 的安全性特征，特别是非人源聚糖，具有潜在的免疫原性。
[0009]糖基化修饰高度依赖于细胞表达系统和亚克隆选择，细胞培养过程中的诸多因素，如培养基的成分，培养条件均会影响糖基化，进而影响治疗性蛋白的生物学活性，疗效，
免疫原性以及药代动力学。
[0010]糖基化参与了蛋白折叠、跨膜转运、细胞粘附、免疫应答等一系列蛋白功能。单克隆抗体药物的糖基化与药物疗效、药物代谢、药物稳定性与免疫原性等成药性关系密切。糖基化修饰可以促进单克隆抗体的稳定性和可溶性，对抗体制备过程中的聚体产生也会存在影响，含有糖基化的蛋白质在生产过程中产生的聚体会减少。
[0011]在单克隆抗体的大规模生产过程中，需要获得安全性、有效性俱佳的产品，对于某些蛋白质生产，就需要减少其糖基化的产生；但是减少糖基化后，又存在影响蛋白质的溶解性、容易产生聚体的问题。

技术实现思路

[0012]抗体的糖基化一方面会产生免疫原性，会引起使用患者的不适；另一方面在抗体的大规模生产过程中，糖基化的存在可以减少聚体的形成，有利于制备后期的抗体纯化。
[0013]为解决上述问题，本专利技术提供的制备方法，可以既获得不含有糖基化的抗体，减少免疫原性；又可以获得不含有聚体且纯度较高的抗体。
[0014]本专利技术提供了一种抗PD-1抗体的制备方法，该方法适用于抗PD-1抗体的大规模生产。该方法所制备的抗PD-1抗体不具有糖基化，不易产生免疫原性，避免患者使用后产生不良反应；同时该方法所提供的抗PD-1抗体的纯化方法，解决了在抗体生产过程中容易产生聚体的技术问题。
[0015]本专利技术提供的抗PD-1抗体的制备方法，其制备的步骤包含抗体的表达及抗体的纯化。
[0016]在本专利技术提供的抗PD-1抗体的制备方法中，抗体的表达选择使用CHO细胞作为抗体表达的宿主细胞，对含有目标蛋白的宿主细胞进行大规模无血清培养，在大规模无血清培养过程中，采用无血清基础培养基、无血清补充培养基流加式培养。
[0017]在本专利技术提供的抗PD-1抗体的制备方法中，其中抗体的纯化步骤包含亲和层析、病毒灭活及聚体去除、离子交换层析、去病毒过滤、超滤浓缩及降低生物负荷过滤。
[0018]本专利技术提供了一种抗PD-1抗体的制备方法，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段具有SEQ ID NO：1（重链CDR1）、SEQ ID NO：2（重链CDR2）、SEQ ID NO：3（重链CDR3）的重链可变区和含有SEQ ID NO：4（轻链CDR1）、SEQ ID NO：5（轻链CDR2）和SEQ ID NO：6（轻链CDR3）的轻链可变区。
[0019]如上所述的抗PD-1抗体是具有SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列、具有SEQ ID NO：10所示的轻链氨基酸序列，具有SEQ ID NO:7所示的重链及SEQ ID NO:9所示轻链的抗PD-1抗体，经无血清培养、培养基（CHOM-BT0001）和补充培养基（CHOM-ST0001）流加式培养后，所得抗PD-1抗体不含有糖基化，其质谱检测显示不含有糖基化。而现有市售抗PD-1抗体含有糖基化。
[0020]如上所述的一种抗PD-1抗体的制备方法，所述无糖基化的抗PD-1抗体的宿主细胞培养表达步骤包括：无血清基础培养基于pH为6.5~7.0，培养温度为33℃~37℃，渗透压为290mOsm/kg~350 mOsm/kg条件下培养；基础培养12-24小时，当细胞生长密度达到2.0-3.5
×
106cells/ml时，补加补无血清补充培养基。
[0021]如上所述的一种抗PD-1抗体的制备方法，所述无糖基化的抗PD-1抗体的宿主细胞
培养表达步骤，一个优选实施例，无血清基础培养基于pH为6.6，培养温度为37℃，渗透压为340 mOsm/kg条件下培养。
[0022]如上所述的一种抗PD-1抗体的制备方法，所述无糖基化的抗PD-1抗体的宿主细胞培养表达步骤，一个优选实施例，无血清补充培养基于pH为6.6，培养温度为34℃，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗PD-1抗体的制备方法，其特征在于，所述抗PD-1抗体的重链可变区含有SEQ ID NO：1所示的CDR1区、SEQ ID NO：2所示的CDR2区、SEQ ID NO：3所示的CDR3区；轻链可变区含有SEQ ID NO：4所示的CDR1区、SEQ ID NO：5所示的CDR2区、SEQ ID NO：6所示的CDR3区；将所述抗PD-1抗体序列转入CHO宿主细胞，进行无血清基础培养基、无血清补充培养基流加式培养，获得无糖基化的抗PD-1抗体。2.根据权利要求1所述的一种抗PD-1抗体的制备方法，其特征在于，所述抗PD-1抗体具有SEQ ID NO：8所示的重链氨基酸序列、具有SEQ ID NO：10所示的轻链氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的一种抗PD-1抗体的制备方法，其特征在于，所述无糖基化的抗PD-1抗体的宿主细胞培养表达步骤包括：无血清基础培养基于pH为6.5~7.0，培养温度为33℃~37℃，渗透压为290mOsm/kg~350 mOsm/kg条件下培养；基础培养12-24小时，当细胞生长密度达到2.0-3.5
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106cells/ml时，补加补无血清补充培养基。4.根据权利要求3所述的一种抗PD-1抗体的制备方法，其特征在于，所述无糖基化的抗PD-1抗体的宿主细胞培养表达步骤中无血清基础培养基于pH为6.6，培养温度为37℃，渗透压为340 mOsm/kg条件下培养。5.根据权利要求3所述的一种抗PD-1抗体的制备方法，其特征在于，所述无糖基化的抗PD-1抗体的宿主细胞培养表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：温云平，戴建新，聂丽，侯盛，寇庚，黄卫红，郭怀祖，郭清城，徐进，张存超，
申请(专利权)人：上海百迈博制药有限公司上海迈泰君奥生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：