一种蛋白质的表达方法技术

本发明专利技术提供了一种蛋白质的表达方法，使用无血清无动物源性培养基，采用基础培养基和补充培养基进行蛋白质类药物的大规模生产表达，基础培养基适用于细胞扩增和灌流培养，补充培养基适用于补充批次培养，该方法所表达的蛋白质药物不含有非人源糖基化。质药物不含有非人源糖基化。

A protein expression method

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质的表达方法


[0001]本专利技术名为分案申请，原案申请号为2019114049586。
[0002]本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及一种蛋白质的表达方法，更具体地本专利技术涉及一种蛋白质药物的CHO细胞表达方法，所表达的蛋白质药物不含有非人源糖基化。

技术介绍

[0003]在蛋白质翻译后的修饰中，糖基化修饰是最重要和最复杂的修饰之一，也是评价蛋白质类药物，如抗体药物质量的关键属性之一。
[0004]蛋白质药物的功能实现与其糖基化修饰密切相关，糖基化修饰会影响蛋白质药物的性能，如构象、稳定性、溶解度、药物代谢动力学、活性及免疫原性等等。
[0005]根据糖基化修饰的位点可以将糖基化分为N位糖基化和O位糖基化，N位糖基化位于Asn-297，寡糖中的N-乙酰氨基葡萄糖与天冬酰胺残基上的酰胺氮连接修饰蛋白质；O位糖基化由寡糖中的N-乙酰半乳糖与丝氨酸或苏氨酸残基上的羟基连接修饰蛋白质。
[0006]动物细胞表达系统所表达的免疫球蛋白中N位的糖基化是最普遍的糖基化修饰，其糖基化修饰位点位于抗体的Fc端，且根据其末端的结构的不同又可分为复合型、杂合型和高甘露糖型。复合型其糖基化以岩藻糖（Fuc）为核心，再由N-乙酰氨基葡萄糖（N-GlcNAc）分出两条等长的分支，其分支上伴以甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）和唾液酸（Sia），由此构成抗体Fc端N位糖基化。根据两条分支中的单糖不同，可将抗体糖基化修饰类型分为G0F、G1F、G2F、G1FS、G2S1F、G2S2F、G0、G1、G2（Fcglycans of therapeutic antibodies as critical quality attributes）。
[0007]不同的糖基化修饰对蛋白质类药物的稳定性和半衰期、安全性及生物活性具有不同的影响。糖基化修饰可以增加蛋白质类药物的稳定性及溶解度。但是，糖基化的存在也会对蛋白质类药物的安全性造成影响，蛋白质类药物糖基化的存在，会影响其施用时的免疫原性，也会对蛋白质类药物的药物代谢动力学及药效动力学产生影响；抗体类药物的糖基化位点往往也是抗体Fc受体（ADCC机制）和C1q（CDC机制）的结合位点，也会影响抗体的生物活性（Engineeredtherapeutic antibodies with improved effector functions）。
[0008]以单克隆抗体为例，糖基化修饰形成的糖链结构能够维持抗体的空间构象、稳定抗体的结构，抗体脱糖基化后对热的稳定性大大降低，糖链结构还能保护抗体不受某些蛋白酶水解。糖链中特别的糖型还与免疫相应功能密切相关，非人源的糖基化，其糖型并非在人体内生物合成，这些非人源的糖基化会具有一定的免疫原性，可加速单克隆抗体的血浆清除。
[0009]糖基化中的唾液酸化作用，在哺乳动物细胞表达系统中主要存在两种类型，分别是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac，NANA），N-羟乙基神经氨酸（Neu5Gc，NGNA）。正常情况下，人类的IgG中含有的唾液酸化类型是Neu5Ac（NANA），而小鼠的IgG中含有的唾液酸化类型是Neu5Gc（NGNA）。
[0010]在蛋白质大规模生产所使用的哺乳动物细胞表达系统中也会产生Gal-α（1,3）-Gal（α-Gal）的糖基化结构，α-Gal（α-半乳糖）是一种非人源的聚糖，具有极强的免疫原性，会引发异体移植中的组织排斥反应，NK细胞能够直接识别该聚糖，若存在高水平的抗α-Gal IgE抗体，使用含有α-Gal聚糖结构的单克隆抗体进行治疗，则会引起严重的超敏反应。
[0011]目前现有蛋白质类药物的大规模生产多是采用动物细胞培养，使用动物细胞大规模培养单克隆抗体、免疫调节因子、特定肿瘤抗原以及各种基因重组的蛋白质类药物。动物细胞同微生物相比具有转录后修饰的功能，能够更高效地表达和生产各类高质量的蛋白质类药物。
[0012]中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary， CHO）是蛋白质类药物大规模生产中常用的培养宿主细胞，CHO细胞表达系统可以表达出与人类蛋白质结构相近的蛋白质类药物，CHO细胞的糖基化的机制同人类的糖基化机制相近，但是CHO细胞的表达，还是会有非人源的糖基化表达，而这些非人源的糖基化会使所表达的蛋白质类药物产生免疫原性，对蛋白质类药物的应用产生副作用，影响其表达的蛋白质类药物的治疗效果。

技术实现思路

[0013]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种蛋白质的表达方法，更具体地本专利技术公开了一种蛋白质药物的CHO细胞表达方法，使用该方法所表达的蛋白质药物不含有非人源糖基化。
[0014]本专利技术采用上海迈泰君奥生物技术有限公司所售的CHOM系列无血清无动物源性培养基，根据培养模式的不同，使用基础培养基和补充培养基进行蛋白质类药物的大规模生产表达，基础培养基适用于细胞扩增和灌流培养，补充培养基适用于补充批次培养。
[0015]CHOM-B系列是一类无血清无蛋白无动物源成分培养基，专门应用于表达抗体等重组蛋白CHO细胞的长期悬浮培养。由于不含L-谷氨酰胺，所以尤其适合与谷氨酰胺合成酶（GS）筛选系统联用。其中，CHOM-B01、CHOM-B02和CHOM-B03是化学成分限定培养基。CHOM-B09是一种无动物源成分培养基，不含L-谷氨酰胺，用于CHO细胞克隆形成及生长。
[0016]CHOM-S系列是为CHOM-B系列量身定做的补充培养基，应用于表达抗体等重组蛋白CHO细胞的批次培养后期添加。该系列补充不含动物源成分及蛋白水解产物，化学成分限定，在提高蛋白产量的同时方便后续纯化及蛋白质的结构解析。
[0017]表1、CHOM系列培养基产品简介
本专利技术提供了一种蛋白质的表达方法，通过该种方法表达的蛋白质类药物不含有非人源糖基化。
[0018]一种蛋白质的表达方法，所述方法包含表达宿主细胞的扩增和灌流培养阶段，及补充培养阶段，在所述细胞扩增和灌流培养阶段使用CHOM-B系列培养基培养，在补充培养阶段使用CHOM-S系列培养基培养。
[0019]一个优选实施例，在细胞扩增和灌流阶段使用CHOM-B系列的组合培养基培养，在补充培养阶段使用CHOM-S系列的组合培养基培养。
[0020]上述方法中所述细胞扩增和灌流培养阶段的组合培养基为CHOM-B01与CHOM-B02组合或CHOM-B01与CHOM-B03组合或CHOM-B01与CHOM-B02及CHOM-B03组合，优选CHOM-B01：CHOM-B02为1:1~1:5，CHOM-B01：CHOM-B03为1:1~1:0.1。
[0021]上述方法中所述补充培养阶段所使用的组合培养基为CHOM-S01与CHOM-S03组合或CHOM-S01与CHOM-S04的组合或CHOM-S01与CHOM-S03及CHOM-S04组合，优选CHOM-S01：CHOM-S03为1:1~1:0.3，CHOM-S01：CHOM-S04为1:1~1:7。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗EGFR抗体的制备方法，其特征在于，所述方法使用无血清、无动物源组分的基础培养基及补充培养基对含有抗EGFR抗体Pan-P基因序列的CHO宿主细胞进行培养表达，所述基础培养基为CHOM-B系列的组合培养基，所述补充培养基为CHOM-S系列的组合培养基。2.根据权利要求1所述的抗EGFR抗体的制备方法，其特征在于，所述方法的CHO宿主细胞的培养表达包含细胞扩增阶段、灌流培养阶段及补充培养阶段，在细胞扩增和灌流培养阶段使用基础培养基，补充培养阶段使用补充培养基。3.根据权利要求2所述的抗EGFR抗体的制备方法，其特征在于，所述CHO宿主细胞灌流培养阶段的条件为：温度为30℃~39℃；基础培养基pH为6.6~7.1；溶氧量30%~60%；每日补充葡萄糖3~5g/L；搅拌转速80~150rpm。4.根据权利要求3所述的抗EGFR抗体的制备方法，其特征在于，所述CHO宿主细胞灌流培养阶段的条件为：温度为35.5℃~36.5℃；基础培养基pH为6.6~6.8；溶氧量30%~40%；每日补充葡萄糖3~5g/L；搅拌转速80~150rpm。5.根据权利要求2所述的抗EGFR抗体的制备方法，其特征在于，所述CHO宿主细胞补充培养阶段的条件为：在灌流培养培养的第2~4天，降低温度至32℃~34℃，pH为7.0~7.3，添加补充培养基，进行补充培养，每日添加补充培养基的量为上灌体积的1%~5%，补充培养8~18天。6.根据权利要求5所述的抗EGFR抗体的制备方法，其特征在于，所述CHO宿...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯盛，郭怀祖，聂丽，郭清城，戴建新，寇庚，徐进，张存超，黄卫红，
申请(专利权)人：上海百迈博制药有限公司上海张江生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：