一种提升短双歧杆菌增殖效率的肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提升短双歧杆菌增殖效率的肽及其应用，属于微生物技术领域。本发明专利技术为解决因氮源利用率低影响短双歧杆菌增殖的问题，提供了一种提升短双歧杆菌增殖效率的方法，该方法以脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽作为培养基的氮源培养短双歧杆菌。利用该方法培养短双歧杆菌，4g/L氮源培养浓度下发酵液OD

【技术实现步骤摘要】
一种提升短双歧杆菌增殖效率的肽及其应用
本专利技术涉及一种提升短双歧杆菌增殖效率的肽及其应用，属于微生物

技术介绍
双歧杆菌(Bifidobacteria)是一类非常重要且被广泛认可的益生菌，具有调节肠道菌群，防治便秘及胃肠障碍；降低胆固醇；延缓机体衰老以及抗肿瘤等作用。鉴于其具有上述有效的益生功能，双歧杆菌也越来越成为人们研究、开发、生产的重点，也被逐渐应用到益生菌乳制品生产中。但是目前商业化应用的双歧杆菌菌株种类较少，主要在于双歧杆菌的制备非常困难，氮源是制约其有效增殖的关键因素之一。关于双歧杆菌生长限制因子的研究表明，氮源是制约其生长的因子，而非葡萄糖。此外，对短双歧杆菌的细胞壁蛋白酶研究发现，其普遍缺失细胞壁蛋白酶，故而无法直接利用外源蛋白，因此，为满足营养需求，在培养过程中需添加氨基酸、小分子肽等物质。然而目前市售酵母浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、鱼骨蛋白胨等多种氮源分子量分布及结构特性差异较大，组分中可被短双歧杆菌利用的肽段含量也有所差异。而目前也是更多的通过单一因素筛选适宜氮源，然而这种方法的添加量往往是过量的，在发酵过程中不被利用的氮源会增加发酵液渗透压，短双歧杆菌的耐渗透压能力较弱，因此将会抑制菌株的最终增殖浓度。基于上述一系列问题，研究短双歧杆菌选择性利用的肽的分子量和结构，提高氮源中可有效促进短双歧杆菌增殖的肽浓度，定向制备其专用氮源显得尤为重要。因此，亟需找到一种适用于短双歧杆菌高效增殖的肽，以提高在短双歧杆菌生长过程中的氮源的利用率、降低企业生产经济并缩短短双歧杆菌的代时，提高短双歧杆菌活菌数的产量。
技术实现思路
本专利技术针对短双歧杆菌培养过程中因氮源利用率低影响短双歧杆菌增殖的问题，提供了一种提升短双歧杆菌增殖效率的方法，所述方法用脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽培养短双歧杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽作为培养基的氮源。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。本专利技术还提供了一种提升短双歧杆菌氮源利用率的方法，所述方法用脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽培养短双歧杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽作为培养基的氮源。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。本专利技术还提供了脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽的制备方法，具体步骤如下：(1)将酪蛋白与水混匀后，加入蛋白酶，进行酶解，经灭酶处理后，沉淀未水解蛋白并离心收集蛋白酶解液，对蛋白酶解液真空冷冻干燥得到酪蛋白酶解物干粉；(2)将酪蛋白酶解物干粉溶于水后，用截流量为2000Da的滤膜进行超滤处理并收集滤液；(3)采用NAK-II大孔树脂对步骤(2)获得的滤液浓缩富集，最后采用纳滤膜收集分子量介于200～800Da的组分，即得分子量为200～800Da的肽。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中酪蛋白浓度为65～75g/L；酪蛋白酶解在恒温pH下进行，酶解温度为45～50℃，pH为6.5～7，酶解时间为4～4.5h；所述蛋白酶选用胰蛋白酶，添加量为3500～4000U/gpro。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中酪蛋白浓度为70g/L，酪蛋白酶解在恒温恒pH下进行，温度为50℃，pH为7，酶解时间为4h，所述蛋白酶选用胰蛋白酶，添加量为4000U/gpro。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)对于酶解完成的酪蛋白水解物，采用沸水浴10min进行灭酶处理，并将pH调整至4.6沉淀未水解物的蛋白，并8000r/min，15min离心取上清。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)对酪蛋白肽混合组分进行NAK-II大孔树脂分离时，洗脱液依次选用浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80％(v/v)的乙醇，流速为1.5mL/min，检测波长为220nm。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)利用截流量为200Da和800Da的纳滤膜收集分子量介于200～800Da的组分。在本专利技术的一种实施方式中，所述的短双歧杆菌菌液的制备方法是通过将短双歧杆菌接种至培养基中进行培养，接种量为2％。在本专利技术的一种实施方式中，测定不同氮源对短双歧杆菌的增殖效果时，氮源的添加量为4g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述的短双歧杆菌最高生长量的测定是将短双歧杆菌接种至培养基中培养至对数期末期并测定OD600。在本专利技术的一种实施方式中，所述的短双歧杆菌包括短双歧杆菌CGMCCNO.11828、短双歧杆菌GDMCCNO:60459、短双歧杆菌GDMCCNO:60605。本专利技术还提供了一种培养基，所述培养基中的氮源为脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。本专利技术还提供了上述提升短双歧杆菌增殖效率的方法、提升短双歧杆菌氮源利用率的方法、脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽的制备方法和上述培养基在培养短双歧杆菌中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种提升短双歧杆菌增殖效率的方法，是利用以脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽为氮源的培养基培养短双歧杆菌。利用该方法培养短双歧杆菌时，4g/L氮源培养浓度下短双歧杆菌OD600高于2.6，显著高于其他氮源，OD600为其他氮源的1.7～2.5倍；与其他氮源相比代时显著缩短，小于2.1h。本专利技术中，依据短双歧杆菌利用肽的分子量及结构特性，结合酶解技术、超滤、纳滤以及NAK-II大孔树脂分离技术，依次对肽组分进行区分浓缩，获得了适宜短双歧杆菌高效增殖的肽，以所述肽为氮源的培养基培养短双歧杆菌，可使氮源利用率达35％以上(其他氮源的利用率仅在10％以下)，有效提高了氮源的利用效率，有效减少氮源的浪费。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步的阐述。下述实施例中涉及的酪蛋白购自于创赛生物科技有限公司；下述实施例中涉及的风味蛋白酶购自于江苏博美达科技有限公司；下述实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提升短双歧杆菌增殖效率的方法，其特征在于，用脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽培养短双歧杆菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种提升短双歧杆菌增殖效率的方法，其特征在于，用脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽培养短双歧杆菌。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽作为培养基的氮源。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2、酵母浸出粉、胡萝卜汁。


4.一种提升短双歧杆菌氮源利用率的方法，其特征在于，用脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽培养短双歧杆菌。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸含量介于17％～21％、分子量介于200～800Da的亲水性肽作为培养基的氮源。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4、柠檬酸氢二铵、吐温、半胱氨酸盐酸盐、CaCl2...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔树茂，汪文丽，毛丙永，唐鑫，赵建新，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32