本发明专利技术提供了一种基于高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测生物样本中口服抗凝血药含量的方法，涉及临床生物样本检测技术领域。所述方法包括：(a)标准品溶液的配制；(b)内标液的配制；(c)生物样本的预处理；(d)在混合内标工作液中分别加入生物样本、标准品溶液、质控品工作液混合后离心，然后取上清液进行高效液相色谱三重四级杆串联质谱；使用的分析色谱柱为C18色谱柱，以流动相A和流动相B混合进行梯度洗脱；所述流动相A为含有0.1～0.5％甲酸水溶液；流动相B为0～0.5％甲酸甲醇溶液。本发明专利技术方法实现了一次性检测生物样本中多种口服抗凝血药的含量，简单高效。简单高效。简单高效。
【技术实现步骤摘要】
一种基于高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测生物样本中口服抗凝血药含量的方法
[0001]本专利技术涉及临床生物样本检测
，尤其是涉及一种基于高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测生物样本中口服抗凝血药含量的方法。
技术介绍
[0002]口服抗凝血药物(NOACs)如达比加群、利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班等通常为固定剂量，且没有常规凝血功能监测。现有临床研究已证实NOACs的疗效至少与维生素K拮抗剂相当，但严重出血事件更少，特别是颅内出血显著更少。这使得无需对出血事件进行监测从而简化了抗凝治疗。NOACs的这种优势以及经过验证的疗效和安全性，可以解释为什么在房颤的卒中预防和静脉血栓栓塞治疗中，与维生素K拮抗剂相比，指南优先推荐NOAC。
[0003]尽管不需要常规监测凝血功能，但仍迫切需要可简单快速检测NOACs的方法。随着昂贵的逆转剂例如达比加群逆转剂艾达赛珠单抗(idarucizumab)、利伐沙班/阿哌沙班/依度沙班逆转剂andexanet alfa的引入，这种需求将逐渐增加。
[0004]当前活化部分凝血活酶时间(aPTT)、凝血酶原时间(PT)是评估达比加群和一些口服凝血因子Xa抑制剂的有价值的指标，但这些检测方法的灵敏度是差别很大，不同药物灵敏度不同。不仅同一个实验室的测试结果解释非常复杂，而且不同实验室之间比较也很困难。这些问题突显出标准化检测的必要性。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于提供一种基于高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测生物样本中口服抗凝血药含量的方法，所述方法实现了一次性检测生物样本中多种口服抗凝血药的含量，简单高效。
[0007]本专利技术提供的技术方案如下：
[0008]一种基于高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测生物样本中口服抗凝血药含量的方法，所述方法包括：
[0009](a)标准品溶液的配制：使用50％～90％甲醇水溶液将标准品储备液配制成混合标准品工作液；将所述混合标准品工作液配制成浓度0.2
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50μg/mL的标准品溶液；
[0010](b)内标液的配制：使用蛋白质沉淀剂稀释同位素内标物储备液，配制成浓度为5～50ng/mL的混合内标工作液；
[0011](c)生物样本的预处理：
[0012](d)吸取混合内标工作液于96孔蛋白沉淀板，分别加入生物样本、标准品溶液、质控品工作液混合后，静置，放置在96孔负压装置上，抽滤，然后取上清液进行高效液相色谱三重四级杆串联质谱；使用的分析色谱柱为C18色谱柱，以流动相A和流动相B混合进行梯度洗脱；所述流动相A为含有0.1～0.5％甲酸水溶液；流动相B为0～0.5％甲酸甲醇溶液。
[0013]在一个实施方案中，所述梯度洗脱的洗脱程序为：
[0014]0.2min时，流动相B15％；
[0015]0.5～0.8min时，流动相B 70％；
[0016]1.00～1.50min时，流动相B升至90％；
[0017]1.51min时，流动相B15％；
[0018]4min时，流动相B15％。
[0019]本专利技术的色谱流动相体系的选择结合特定的洗脱程序，可以提高信噪比，使得达比加群、利伐沙班、阿哌沙班和艾多沙班的出峰更明显。
[0020]在一个实施方案中，所述色谱柱的柱温为30
‑
40℃；流动相流速为0.2～0.6mL/min；进样量为2～10μL。
[0021]在一个实施方案中，所述蛋白质沉淀剂包括甲醇或乙腈。
[0022]优选地，所述蛋白质沉淀剂为甲醇。
[0023]在一个实施方案中，步骤(c)中的离心条件为离心速度500～3000rpm，离心10～30min；
[0024]步骤(d)中吸取混合内标工作液于96孔蛋白沉淀板，分别加入生物样本、标准品溶液、质控品工作液混合后，静置，放置在96孔负压装置上，抽滤，然后取上清液进行高效液相色谱三重四级杆串联质谱；极大的缩短了前处理操作时间，更有利于临床推广。
[0025]在一个具体的实施方案中，将1
‑
2mL待检生物样本(如血液)在离心速度为1500～3000rpm下离心10～30min，得到上清液，置于
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80℃备用。
[0026]在一个实施方案中，所述方法还包括质控品工作液的配制，包括使用50％～90％甲醇水溶液稀释质控品储备液，分别配制低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)、高浓度质控品(HQC)的混合质控品工作液。
[0027]在一个实施方案中，所述标准品储备液和所述质控品储备液为用DMSO溶解达比加群、利伐沙班、阿哌沙班和艾多沙班标准品配制而成。
[0028]在一个实施方案中，所述混合标准品工作液包括5～9种不同浓度，分别为：
[0029][0030][0031]在一个实施方案中，所述同位素内标物为氘代同位素内标，包括达比加群
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d3、利伐沙班
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d4、阿哌沙班
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d3和艾多沙班
‑
d6。
[0032]在一个具体的实施方案中，质控品配制中，生物样本加标浓度如下表。
[0033]分析物LQCμg/mLMQCμg/mLHQCμg/mL
达比加群0.01～0.10.1～0.30.3～0.5利伐沙班0.01～0.10.1～0.30.3～0.5阿哌沙班0.01～0.10.1～0.30.3～0.5艾多沙班0.01～0.10.1～0.30.3～0.5
[0034]在一个实施方案中，质谱采用电喷雾离子源和多反映监测的扫描模式；
[0035]质谱条件为电喷雾质谱正离子模式；离子源温度：300～600℃；离子源电压：4500～5000V；碰撞气：9～10unit；气帘气：40～50psi；GS1:50～60psi；GS2：50～60psi。
[0036]所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测采用电喷雾离子源(ESI)和多反映监测(MRM)扫描模式，具体的离子对如下表。
[0037]分析物离子对内标离子对达比加群472.2
→
289.2达比加群
‑
d3475.2
→
292.2利伐沙班436.1
→
144.9利伐沙班
‑
d4440.1
→
144.9阿哌沙班460.2
→
199.1阿哌沙班
‑
d3463.2
→
202.1艾多沙班548.2
→
366.3艾多沙班
‑
d6554.2
→
372.4
[0038]本专利技术选择的离子对作为质谱检测离子，有利于4种物质的精确定量灵敏度的提高。
[0039]在一个实施方案中，所述生物样本包括血浆和/或血清；优选地，所述生物样本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测生物样本中口服抗凝血药含量的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)标准品溶液的配制：使用50％～90％甲醇水溶液将标准品储备液配制成混合标准品工作液；将所述混合标准品工作液配制成浓度0.2
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50μg/mL的标准品溶液；(b)内标液的配制：使用蛋白质沉淀剂稀释同位素内标物储备液，配制成浓度为5～50ng/mL的混合内标工作液；(c)生物样本的预处理：将待测生物样本离心后得到上清液；(d)吸取混合内标工作液于96孔蛋白沉淀板，分别加入生物样本、标准品溶液、质控品工作液混合后，静置，放置在96孔负压装置上，抽滤，然后取上清液进行高效液相色谱三重四级杆串联质谱；使用的分析色谱柱为C18色谱柱，以流动相A和流动相B混合进行梯度洗脱；所述流动相A为含有0.1～0.5％甲酸水溶液；流动相B为0～0.5％甲酸甲醇溶液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱程序为：0.2min时，流动相B15％；0.5～0.8min时，流动相B 70％；1.00～1.50min时，流动相B升至90％；1.51min时，流动相B15％；4min时，流动相B15％。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为30
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40℃；流动相流速为0.2～0.6mL/min；进样量为2～10μL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质沉淀剂包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：周洲，王恺隽，赵丽平，肖滋兰，栗琳，丁亮，何启鑫，
申请(专利权)人：江苏豪思睦可生物科技有限公司北京豪思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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