针对趋化因子CX3CL1的抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种针对CX3CL1的人源化抗体或其片段，抗体或其片段的编码核酸和包含抗体或其片段的组合物等，以及它们在治疗疾病中的用途。本发明专利技术提供的抗体或其片段对CX3CL1具有高亲和力，特异性阻断CX3CL1/CX3CR1信号通路，阻断CX3CR1表达细胞的迁移活性。阻断CX3CR1表达细胞的迁移活性。

【技术实现步骤摘要】
针对趋化因子CX3CL1的抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体而言，本专利技术涉及特异性结合趋化因子CX3C亚型CX3CL1的抗体及其抗原结合片段，以及所述抗体及其抗原结合片段的应用。

技术介绍

[0002]趋化因子是一类功能相关的小分子分泌蛋白，因其具有白细胞趋化性和细胞因子活性而被命名为“趋化因子”。在人体内，这个家族由大约50种相关分子组成，在其他哺乳动物也有相近的同系物。趋化因子20％～95％的序列包含保守的半胱氨酸残基，根据半胱氨酸的数量和间距，被分为四种亚型：CC，CXC，XC和CX3C亚型(C为半胱氨酸，X为任意氨基酸)。
[0003]CX3C亚型只有一个趋化因子CX3CL1，也称为不规则趋化因子(fractalkine，FKN)或神经元趋化因子(neurotactin)，是唯一膜结合性趋化因子。CX3CL1在多种细胞中表达，其唯一的受体为趋化因子受体CX3CR1。CX3CR1是一种7次跨膜域G蛋白偶联受体。正常情况下，机体的自然杀伤细胞(NK细胞)、单核细胞、肥大细胞、血小板和效应T细胞膜上均有CX3CR1的表达。
[0004]在炎症性细胞从外周循环中到达炎症部位的过程中，CX3CL1/CX3CR1起到了至关重要的作用。受体CX3CR1与配体CX3CL1结合后，引发钙离子内流而产生细胞趋化反应，从而诱导细胞到生物体的特定部位。CX3CR1参与一些炎症过程主要是通过诱导并招募NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、效应T细胞，使其到达炎症的部位实现的。CX3CR1不仅对这些细胞具有趋化作用，同时由于CX3CR1具有一个特殊的粘蛋白茎结构，CX3CR1还具有很好的粘附炎性细胞的作用，这使得CX3CR1在炎症的发生及发展的病理过程中发挥重要的作用。研究表明，许多疾病的病理改变的发生都与CX3CR1有着密不可分的关联。
[0005]日本卫材公司通过传统的杂交瘤技术，成功筛选得到了1个高亲和力的针对人CX3CL1的小鼠单克隆抗体3A5-2。经过人源化改造后的抗体H3-2L4仍保持了与人CX3CL1的高亲和力(参见CN102597003A)，目前已处于类风湿、克罗恩氏病等的临床2期或临床1/2期研究中。但是，H3-2L4人源化抗体还保留了较多的鼠源氨基酸，在人体内引起排斥免疫反应的概率相对比较高；另外，其与靶点结合的CDR区还保留了若干翻译后修饰位点，在人体内存在因为被修饰而丧失生物活性的风险。

技术实现思路

[0006]为了最大程度地减少抗体引起的排斥免疫反应，应使人治疗用抗体倾向尽量少地包含鼠源氨基酸。为了解决这一技术问题，本专利技术旨在通过更加优化的人源化设计最大程度减少目标抗体的鼠源氨基酸的数目，使之预期拥有更好的体内安全性。
[0007]此外，本专利技术还旨在通过细胞表面展示技术对人源化后的抗体的6个CDR氨基酸进行随机突变建库，来筛选出具有更高亲和力的抗体分子；并且，还可对亲和力成熟后的抗体进行第二次工程改造，构建可变区全序列随机突变抗体库，以筛选得与小鼠CX3CL1以高亲和力结合的抗体，为在小鼠模型中研究CX3CL1相关疾病作用机制提供抗体选择。
[0008]针对上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种抗人趋化因子CX3CL1的抗体或其片段，尤其是人源化抗体或其片段，相比于现有CX3CL1人源化抗体，本专利技术提供的抗体具有更少的鼠源氨基酸，且对CX3CL1的亲和力更高。本专利技术的目的还在于提供进一步得到的与小鼠CX3CL1具有高亲和力的抗体。基于前述，本专利技术的目的还在于提供这些抗体的应用。
[0009]具体而言，本专利技术提供以下技术方案。
[0010]本专利技术所述抗体的“片段”涵盖抗体的各种功能性片段，例如其抗原结合部分，如Fab、F(ab
’
)2或scFv片段。
[0011]所述CX3CL1是指不规则趋化因子(fractalkine)或神经元趋化因子(neurotactin)。优选地，所述CX3CL1为灵长类哺乳动物CX3CL1，更优选为人CX3CL1。
[0012]一方面，本专利技术提供一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL/VK)，其中所述重链可变区(VH)包含来自以下序列中任一个所示的重链可变区的3个CDR(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)：
[0013]SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；和/或
[0014]其中所述轻链可变区(VL)包含来自以下序列中任一个所示的轻链可变区的3个CDR(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)：
[0015]SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31。
[0016]优选地，本专利技术提供的抗体或其片段中，所述重链可变区(VH)包含来自以下序列中任一个所示的重链可变区的3个CDR(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)：
[0017]SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；和/或
[0018]其中所述轻链可变区(VL)包含来自以下序列中任一个所示的轻链可变区的3个CDR(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)：
[0019]SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31。
[0020]根据本专利技术的具体实施方式，本专利技术提供的抗体或其片段中，所述重链可变区(VH)和所述轻链可变区(VL)包含来自以下序列组合所示的6个CDR(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)：
[0021](1)SEQ ID NO:11+SEQ ID NO:23；
[0022](2)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:22；
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[0024](4)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:24；
[0025](5)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:25；
[0026](6)SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)包含来自以下序列中任一个所示的重链可变区的3个CDR(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；和/或其中所述轻链可变区(VL)包含来自以下序列中任一个所示的轻链可变区的3个CDR(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31。2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区(VH)包含来自以下序列中任一个所示的重链可变区的3个CDR(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；和/或其中所述轻链可变区(VL)包含来自以下序列中任一个所示的轻链可变区的3个CDR(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31。3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区(VH)和所述轻链可变区(VL)包含来自以下序列组合所示的6个CDR(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)：(1)SEQ ID NO:11+SEQ ID NO:23；(2)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:22；(3)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:23；(4)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:24；(5)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:25；(6)SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:22；(7)SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:23；(8)SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:24；(9)SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:25；(10)SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:22；(11)SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:23；(12)SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:24；(13)SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:25；(14)SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:22；(15)SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:23；(16)SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:24；(17)SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:25；(18)SEQ ID NO:26+SEQ ID NO:29；
(19)SEQ ID NO:26+SEQ ID NO:30；(20)SEQ ID NO:26+SEQ ID NO:31；(21)SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:29；(22)SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:30；(23)SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:31；(24)SEQ ID NO:28+SEQ ID NO:29；(25)SEQ ID NO:28+SEQ ID NO:30；或(26)SEQ ID NO:28+SEQ ID NO:31；优选地，所述重链可变区(VH)和所述轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合：(1)依次示于SEQ ID NO:37、44、42的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(2)依次示于SEQ ID NO:37、41、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(3)依次示于SEQ ID NO:37、41、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(4)依次示于SEQ ID NO:37、41、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(5)依次示于SEQ ID NO:37、41、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(6)依次示于SEQ ID NO:37、44、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(7)依次示于SEQ ID NO:37、44、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(8)依次示于SEQ ID NO:37、44、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(9)依次示于SEQ ID NO:37、44、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(10)依次示于SEQ ID NO:37、41、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(11)依次示于SEQ ID NO:37、41、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(12)依次示于SEQ ID NO:37、41、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(13)依次示于SEQ ID NO:37、41、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(14)依次示于SEQ ID NO:37、44、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(15)依次示于SEQ ID NO:37、44、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(16)依次示于SEQ ID NO:37、44、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(17)依次示于SEQ ID NO:37、44、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(18)依次示于SEQ ID NO:53、54、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(19)依次示于SEQ ID NO:53、54、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、56、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(20)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(21)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、56、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(22)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(23)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、56、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；(24)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区包含选自以下的序列：示于SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区包含选自以下的序列：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；优选地，所述抗体或其片段包含的重链可变区和轻链可变区选自以下组合：(1)示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:23的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：林鉴，蔺利娟，朱戬，王晋，吴建，王骊淳，任红媛，毕建军，
申请(专利权)人：上海普铭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：