一种与参照分子具有相同或不同的靶蛋白结合的分子的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种与参照分子具有相同或不同的靶蛋白结合的分子的筛选方法，所述方法在生物分子相互作用分析系统上进行，包括设置NTA芯片的实验组1、对照组1、实验组2和对照组2，使各组芯片如下结合靶蛋白（A）、参照分子（Ab1）与待测分子（Ab2）：实验组1 A‑Ab1‑Ab2；对照组1 A‑Ab1‑0；实验组2 A‑0‑Ab2；对照组2 A‑0‑0，通过检测结合信号并计算（实验组1‑对照组1）/（实验组2‑对照组2）的比值，来判断待测分子是否与参照分子竞争与靶蛋白的结合。本发明专利技术的方法可针对多个参照分子同时进行筛选，且可直接进行杂交瘤细胞培养上清的筛选，具有样品适用性强、灵敏度高、通量高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种与参照分子具有相同或不同的靶蛋白结合的分子的筛选方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体而言，本专利技术涉及一种与已知参照分子具有相同或不同的靶蛋白结合的新分子筛选鉴定方法。
技术介绍
单克隆抗体技术已成为重要的临床诊断手段和有效的药物治疗方法，特别是治疗性单克隆抗体已成为近几年来生物制药业发展最快的领域之一。同时，单克隆抗体技术也为一些新技术提供了基础平台，如抗体偶联药物、双特异性抗体及新兴的CAR-T细胞治疗。抗体功能取决于其与靶抗原结合的表位，表位是抗原的一部分，与抗体的可变区结合，与不同表位结合发挥特定的功能。单克隆抗体与相应抗原的反应性决定于所识别的抗原表位，确定相应表位在抗原结构上的位置是单克隆抗体筛选中的关键步骤。同时，可进一步分析这类表位的差异，正确评价单克隆抗体的特异性和交叉反应性，例如可用于评价某抗原表位是某种菌株不同血清型的共同表位，还是特异表位。与传统的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体的效力仍相对较低，仅用一种中和性单克隆抗体时，其效力可能会由于表位的突变受到抑制。为提高用药效力、扩大特异性，可将对靶抗原有不同特异性的单克隆抗体混合作用，这种混合的单克隆抗体可能会出现协同作用，其效力超过每种单克隆抗体效力之和。例如，单克隆抗体鸡尾酒药物CL184由两种针对不同表位的单克隆抗体混合而成，用于狂犬病的暴露后预防。在这种情况下，就更需要对不同的单克隆抗体进行表位分析来判断其结合的表位是否相同，甚至完全明确其结合的表位序列。现有常用的抗原表位分析方法有酶联免疫吸附法（ELISA法）、生物酶解法及化学切割法、噬菌体随机肽库，X-射线晶体学、丙氨酸扫描、氢氘交换质谱、生物信息学表位预测。其中，竞争ELISA法是单克隆抗体表位分析最常用的方法，这种方法的基本原理为双抗体竞争，抗原包板后同时加入未标记的待检单克隆抗体和酶标的对照单克隆抗体，当两种单克隆抗体的表位特异性相同时，酶标对照单克隆抗体与待检单克隆抗体发生竞争，从而出现抑制现象。但是，使用ELISA法进行表位分析，前期需要对已知抗体浓度进行大量实验性摸索，优化出最优浓度，操作繁琐费时；待测样品通常为浓度已知的纯化的抗体，培养基中的其它物质会对ELISA结果有较强干扰；且已知抗体需额外的标记，或使用不同种属或亚型的已知抗体以便于最终的检测。最重要的是，ELISA法不能对待测抗体与多种已知抗体同时进行表位分析，从而大大增加了操作者的劳动量，难以实现大规模高通量快速筛选。生物膜干涉技术(Bio-1ayerinterferometry，BLI)是一种实时、无需标记的快速检测技术，其原理是当生物分子结合到芯片表面形成一层生物膜层，该生物膜层对透过芯片的光的波形造成干涉现象。干涉现象以相位移动的方式被检测，可以检测结合到芯片分子数量的变化。BLI技术已经成功应用于蛋白质分子间相互作用的检测，尤其是抗体的亲和力测定，样品用量少，可检测亲和力范围广泛，可得到kon、koff、KD等动力学参数。已提出利用BLI可分析抗原抗体之间的表位，但是在分析抗体分子之间表位竞争关系或筛选与已知抗体的表位相同或者不同的新抗体分子这一方面，BLI尚未得到充分开发和利用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，基于生物膜干涉技术，针对多个不同表位的已知抗体同时筛选与其中任一个抗体具有相同或不同抗原结合、特别是相同或不同抗原表位的新抗体分子，从而节约抗体高通量筛选的时间和工作量；并且，在筛选时，可将杂交瘤细胞培养上清作为待测样品，从而直接鉴定该上清中是否存在所述新抗体分子，进一步提高抗体筛选效率。因此，本专利技术的目的是提供一种与已知分子具有相同或不同结合的抗体筛选方法，所述方法基于生物膜干涉技术。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种与参照分子具有相同或不同的靶蛋白结合的分子的筛选方法，所述方法在生物分子相互作用分析系统上进行，包括以下步骤：(1)设置实验组1、对照组1、实验组2和对照组2，各组芯片在缓冲液中平衡，然后浸入靶蛋白在缓冲液中的溶液以固化靶蛋白；(2)使实验组1、对照组1的芯片再次在缓冲液中平衡，然后浸入参照分子在缓冲液中的溶液以使靶蛋白结合参照分子至饱和，再次在缓冲液中平衡；之后使实验组1的芯片浸入包含待测分子的样品，同时使对照组1的芯片浸入不包含待测分子的对照溶液；并且，使实验组2、对照组2的芯片再次在缓冲液中平衡，然后使实验组2的芯浸入所述样品，同时使对照组2的芯片浸入所述对照溶液；(3)检测各实验组和对照组的结合信号，计算（实验组1-对照组1）/（实验组2-对照组2）的比值，比值为60%-100%表明待测分子与参照分子完全不竞争与靶蛋白的结合，比值为30-60%表明待测分子与参照分子部分竞争与靶蛋白的结合，比值为<30%表明待测分子与参照分子完全竞争与靶蛋白的结合。优选地，在本专利技术的筛选方法中，所述生物分子相互作用分析系统基于生物膜干涉技术或表面离子共振技术，包括但不限于fortebio或biacore生物分子相互作用分析系统。优选地，在本专利技术的筛选方法中，所述靶蛋白为抗原。优选地，在本专利技术的筛选方法中，所述参照分子为一种或多种特异性结合靶蛋白的抗体。根据本专利技术的具体实施方式，所述参照分子为四种特异性结合抗原的抗体。优选地，在本专利技术的筛选方法中，所述待测分子为抗体。优选地，在本专利技术的筛选方法中，所述样品为待测分子在缓冲液中的溶液或包含待测分子的细胞培养液；所述对照溶液为缓冲液或细胞培养基。优选地，在本专利技术的筛选方法中，所述样品为待测分子在缓冲液中的溶液或包含待测分子的单克隆杂交瘤细胞培养上清；所述对照溶液为缓冲液或单克隆杂交瘤细胞培养基。优选地，在本专利技术的筛选方法中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液+0.1%BSA+0.02%吐温20+0.05%Priclin300，pH7.4。优选地，在本专利技术的筛选方法中，所述平衡为将芯片在所述缓冲液中放置60s。优选地，在步骤(1)中，固化靶蛋白至信号高度2nm。优选地，在步骤(2)中，使实验组1的芯片浸入样品300s，并且使对照组1的芯片浸入对照溶液300s。优选地，在步骤(2)中，使实验组2的芯片浸入样品接触300s，并且使对照组2的芯片浸入对照溶液300s。优选地，所述参照分子为一种或多种特异性结合靶蛋白的抗体，并且每种参照分子在缓冲液中的浓度为66.6-200nM。根据本专利技术的具体实施方式，每种参照抗体在缓冲液中的浓度为200nM。根据本专利技术的具体实施方式，所述靶蛋白为人补体C5蛋白，在缓冲液中的浓度为10-100nM，例如10、12.5、25、50或100nM，优选50nM。根据本专利技术的具体实施方式，所述参照分子为以下中的任一种或多种：抗体1，重链可变区示于SEQIDNO:1，轻链可变区示于SEQIDNO:2；抗体2，重链可变区示于SEQIDNO:3，轻链可变区示于SEQIDNO:4；抗体3，重链可变区示于SEQIDNO:5，轻链可变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与参照分子具有相同或不同的靶蛋白结合的分子的筛选方法，所述方法在生物分子相互作用分析系统上进行，包括以下步骤：/n(1)设置实验组1、对照组1、实验组2和对照组2，各组芯片在缓冲液中平衡，然后浸入靶蛋白在缓冲液中的溶液以固化靶蛋白；/n(2)使实验组1、对照组1的芯片再次在缓冲液中平衡，然后浸入参照分子在缓冲液中的溶液以使靶蛋白结合参照分子至饱和，再次在缓冲液中平衡；之后使实验组1的芯片浸入包含待测分子的样品，同时使对照组1的芯片浸入不包含待测分子的对照溶液；/n使实验组2、对照组2的芯片再次在缓冲液中平衡，然后使实验组2的芯片浸入所述样品，同时使对照组2的芯片浸入所述对照溶液；/n(3)检测各实验组和对照组的结合信号，计算（实验组1-对照组1）/（实验组2-对照组2）的比值，比值为60%-100%表明待测分子与参照分子完全不竞争与靶蛋白的结合，比值为30-60%表明待测分子与参照分子部分竞争与靶蛋白的结合，比值为<30%表明待测分子与参照分子完全竞争与靶蛋白的结合。/n

【技术特征摘要】
1.一种与参照分子具有相同或不同的靶蛋白结合的分子的筛选方法，所述方法在生物分子相互作用分析系统上进行，包括以下步骤：
(1)设置实验组1、对照组1、实验组2和对照组2，各组芯片在缓冲液中平衡，然后浸入靶蛋白在缓冲液中的溶液以固化靶蛋白；
(2)使实验组1、对照组1的芯片再次在缓冲液中平衡，然后浸入参照分子在缓冲液中的溶液以使靶蛋白结合参照分子至饱和，再次在缓冲液中平衡；之后使实验组1的芯片浸入包含待测分子的样品，同时使对照组1的芯片浸入不包含待测分子的对照溶液；
使实验组2、对照组2的芯片再次在缓冲液中平衡，然后使实验组2的芯片浸入所述样品，同时使对照组2的芯片浸入所述对照溶液；
(3)检测各实验组和对照组的结合信号，计算（实验组1-对照组1）/（实验组2-对照组2）的比值，比值为60%-100%表明待测分子与参照分子完全不竞争与靶蛋白的结合，比值为30-60%表明待测分子与参照分子部分竞争与靶蛋白的结合，比值为<30%表明待测分子与参照分子完全竞争与靶蛋白的结合。


2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述生物分子相互作用分析系统基于生物膜干涉技术或表面离子共振技术。


3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述生物分子相互作用分析系统为fortebio或biacore生物分子相互作用分析系统。


4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述靶蛋白为抗原。


5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述参照分子为一种或多种特异性结合靶蛋白的抗体。


6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述待测分子为抗体。


7.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述样品为待测分子在缓冲液中的溶液或包含待测分子的细胞培养液；所述对照溶液为缓冲液或细胞培养基。


8.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述样品为待测分子在缓冲液中的溶液或包含待测分子的单克隆杂交瘤细胞培养上清；所述对照溶液为缓冲液或单克隆杂交瘤细胞培养基。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的筛选方法，其特征在于，在步骤(1)和步骤(2)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液+0.1%BSA+0.02%吐温20+0.05%Priclin300，pH7.4。


10.根据权利要求1至8中任一项所述的筛选方法，其特征在于，在步骤(1)和步骤(2)中，所述平衡为将芯片在所述缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：高攀，王雪，吴建，李祥烽，陶春艳，王骊淳，任红媛，
申请(专利权)人：上海普铭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31