用于检测高危型HPV病毒的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于检测高危型HPV病毒的试剂盒及检测方法。用于检测高危型HPV病毒的试剂盒是由恒温扩增区、金标制备区和胶体金试纸条组成；恒温扩增区是由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂是由解旋酶、单链DNA结合蛋白、Klenow‑I DNA聚合酶、四种dNTP混合物和buffer组成，第二试剂为HPV特异性扩增引物溶液；金标制备区包括胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液；胶体金试纸条是由被衬底板、样品垫、金标垫、基膜和吸水垫组成，被衬底板上从左到右依次设置有样品垫、金标垫、基膜和吸水垫。本发明专利技术操作便捷并有效提高了检测特异性及反应灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
用于检测高危型HPV病毒的试剂盒及检测方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种用于检测高危型HPV病毒的试剂盒及检测方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。在世界范围妇女中，宫颈癌(CC)及其癌前病变是列第三位的非常普遍的恶性疾病。最常见的宫颈癌发病因素为高危型HPV感染，其中HPV16、HPV18型与宫颈癌发病的关系最为密切。HPV16感染主要导致宫颈鳞癌，HPV18感染主要导致宫颈腺癌。我国宫颈癌新发病例约为6.2万例，占全球新发病例的12％，死亡病例约3万例，占全球死亡病例的11％。现已明确宫颈癌与高级别宫颈鳞状上皮内病变(HSIL，包括CINⅡ/Ⅲ级)的发生、发展主要由高危型HPV持续感染所致。在发达国家由于宫颈癌筛查制度的建立与完善，子宫颈浸润癌的发病率和死亡率已大幅度下降，但在广大发展中国家，要在短期内进行大规模、覆盖广泛、高质量的宫颈癌普查存在较大困难。我国总体人群筛查率处于低水平，2010年全国城市平均子宫颈癌筛查率为29.1％，农村仅为16.9％。HPVDNA检测多采用qPCR技术以提高HPV检出率，但其检测成本相对较高，有特殊检测设备的要求，限制了其临床应用。核酸检测技术近年来发展迅速，尤其是在分子诊断POCT领域。其中，荧光PCR(qPCR)特异性强、灵敏度高，可以定量对病原体进行检测，但热循环过程需要热循环仪，热循环仪体积大、价格高、耗时长，使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。恒温扩增技术不需要加热循环，在恒定温度下即可使新合成的DNA模板退火变性而引发进一步扩增反应，具备价格低廉、检测快速等优势，更适合于进行基层推广和现场检测。恒温扩增技术中依赖解旋酶的恒温基因扩增(Helicase-dependentamplification,HDA)是美国NewEnglandBiolabs的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制，专利技术的一种体外恒温基因扩增技术，与其它恒温扩增技术相比，引物设计简单，操作便捷，不需要昂贵的PCR仪，更适合在基层实验室推广应用。先前研究证实，CRISPR/Cas系统是近年来兴起的一项靶向基因编辑工具，已广泛用于动植物、细菌、真菌、寄生虫等的靶向基因编辑。在众多类型的CRISPR/Cas系统当中，CRISPR/dCas9系统已被证实可用于核酸检测，具备灵敏高效、制备简单、成本低廉等诸多优势。但目前尚无将其应用于高危型HPVDNA检测的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，灵敏性高、特异性强且价格低廉；本专利技术同时提供了检测方法。本专利技术所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒是由恒温扩增区、金标制备区和胶体金试纸条组成；恒温扩增区是由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂是由解旋酶、单链DNA结合蛋白、Klenow-IDNA聚合酶、四种dNTP混合物和buffer组成，第二试剂为HPV特异性扩增引物溶液；金标制备区包括胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液；胶体金试纸条是由被衬底板、样品垫、金标垫、基膜和吸水垫组成，被衬底板上从左到右依次设置有样品垫、金标垫、基膜和吸水垫；基膜上从左到右依次设置有T1线、T2线和C线，其中，C线上包被有dCas9抗体，T1线上包被有16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物，T2线上包被有18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物。所述的HPV特异性扩增引物来源于HPV基因组的多态性的L1区域内。所述的HPV特异性扩增引物为16型HPV的扩增引物和18型HPV的扩增引物的混合物，16型HPV的扩增引物为F：CACAAACATATATTATCATGC和R：CAGTATCAACCATATCACCATC，18型HPV的扩增引物为F：CACAAGCATATTTTATCATGC和R：CAGTATCTACCATATCACCATC。所述的胶体金标记的dCas9蛋白溶液中dCas9具有SEQIDNO.9所示的氨基酸序列。所述的gRNA为HPV16gRNA和HPV18gRNA的混合物，HPV16gRNA和HPV18gRNA的摩尔比为1：1，HPV16gRNA序列为GTAGGTCGTGGTCAGCCATT，HPV18gRNA序列为GCCCAGTGTTCCCCAATAGC。HPV16gRNA序列如SEQIDNO.5所示，HPV18gRNA序列如SEQIDNO.6所示。所述的金标制备区还包括无RNase1.5mlEP管和无RNase1ml带刻度吸管。所述的16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物中16型HPV基因片段序列为AAAAAACCTAACAATAACAAAATATTAG，如SEQIDNO.7所示。所述的18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物中18型HPV基因片段序列为CCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA，如SEQIDNO.8所示。所述的dCas9抗体为购自Abcam的货号为ab191468的抗体。所述的第一试剂组成如下：buffer为25mmol/LTris-HCL、12mmol/LKCL、50mmol/LNaCL和5mmol/LMgSO4，pH＝7.4。采用本专利技术所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：(1)从待检样品中提取HPV病毒基因组；(2)将HPV病毒基因组、第一试剂和第二试剂混合后进行恒温扩增，得到扩增产物；(3)将胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液混合，恒温孵育后滴入金标垫中；(4)将步骤(2)得到的扩增产物滴入样品垫中，待15-30min后观察结果；(5)结果判断：如果T1线和C线同时出现，则为16型HPV阳性；如果T2线和C线同时出现，则为18型HPV阳性；如果只有C线出现，则为16型HPV阴性，18型HPV阴性；如果C线不出现，则结果无效。步骤(2)中所述的HPV病毒基因组、第一试剂和第二试剂的体积比为5-8:40-50:5-8。步骤(2)中所述的恒温扩增温度为37℃，恒温扩增时间为75-90min。步骤(3)中所述的胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液的体积比为1:1。步骤(3)中所述的恒温孵育温度为37℃，恒温孵育时间为30-35min。HPV病毒基因组的提取是采用上海康朗生物科技有限公司的DNA/RNA提取试剂盒进行提取，所得HPV病毒基因组DNA无蛋白、核酸酶或其它杂质的污染，可直接用于PCR、酶切、杂交、反转录等分子生物学实验。本专利技术采用依赖解旋酶的恒温扩增技术(HDA)，先用解旋酶解开双链DNA，再依靠单链DNA结合蛋白(SSB)与模板单链结合，使模板单链处于单链状态并保护它的完整性，引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶催化下扩增，新生成的双链DNA产物作为底物进入下一轮扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，其特征在于由恒温扩增区、金标制备区和胶体金试纸条组成；/n恒温扩增区是由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂是由解旋酶、单链DNA结合蛋白、Klenow-IDNA聚合酶、四种dNTP混合物和buffer组成，第二试剂为HPV特异性扩增引物溶液；/n金标制备区包括胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液；/n胶体金试纸条是由被衬底板、样品垫、金标垫、基膜和吸水垫组成，被衬底板上从左到右依次设置有样品垫、金标垫、基膜和吸水垫；/n基膜上从左到右依次设置有T1线、T2线和C线，其中，C线上包被有dCas9抗体，T1线上包被有16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物，T2线上包被有18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，其特征在于由恒温扩增区、金标制备区和胶体金试纸条组成；
恒温扩增区是由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂是由解旋酶、单链DNA结合蛋白、Klenow-IDNA聚合酶、四种dNTP混合物和buffer组成，第二试剂为HPV特异性扩增引物溶液；
金标制备区包括胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液；
胶体金试纸条是由被衬底板、样品垫、金标垫、基膜和吸水垫组成，被衬底板上从左到右依次设置有样品垫、金标垫、基膜和吸水垫；
基膜上从左到右依次设置有T1线、T2线和C线，其中，C线上包被有dCas9抗体，T1线上包被有16型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物，T2线上包被有18型HPV基因片段-牛血清白蛋白复合物。


2.根据权利要求1所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，其特征在于所述的HPV特异性扩增引物为16型HPV的扩增引物和18型HPV的扩增引物的混合物，16型HPV的扩增引物为F：CACAAACATATATTATCATGC和R：CAGTATCAACCATATCACCATC，18型HPV的扩增引物为F：CACAAGCATATTTTATCATGC和R：CAGTATCTACCATATCACCATC。


3.根据权利要求1所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，其特征在于所述的胶体金标记的dCas9蛋白溶液中dCas9具有SEQIDNO.9所示的氨基酸序列。


4.根据权利要求1所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，其特征在于所述的gRNA为HPV16gRNA和HPV18gRNA的混合物，HPV16gRNA和HPV18gRNA的摩尔比为1：1，HPV16gRNA序列为GTAGGTCGTGGTCAGCCATT，HPV18gRNA序列为GCCCAGTGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗莹，王清路，陈菊，
申请(专利权)人：淄博市中心医院，
类型：发明
国别省市：山东;37