一种犬细小病毒的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种犬细小病毒的检测方法，该方法包括如下步骤：以单克隆抗体4C11作为包被抗体，铕Eu

【技术实现步骤摘要】
一种犬细小病毒的检测方法
本专利技术涉及病毒检测
，具体的说涉及一种犬细小病毒的检测方法。
技术介绍
犬细小病毒感染是由犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)感染引起的，以严重肠炎综合征和心肌炎综合征为特征的犬科和鼬科动物的重要传染病。该病在世界范围内流行，CPV也是我国出入境口岸宠物检疫的重要疫病之一。传统的CPV检测方法包括血凝和血凝抑制试验、病毒分离鉴定、酶联免疫吸附试验、电镜和免疫电镜观察等。这些方法存在特异性差、灵敏度低、耗时长、操作繁琐等不足之处。胶体金方法尽管可以实现快速检测，但在敏感性和准确性上均有待提高，如需确诊往往需要通过更灵敏和准确的分子生物学方法。分子病毒学方法PCR、套式PCR、荧光定量PCR、LAMP(环介导等温扩增)等方法需要配备价格昂贵的仪器设备，不便于实现现场检疫。因此，开发一种新的检测方法，快速、敏感、特异、准确地检测犬细小病毒对该疾病的预防和治疗具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种犬细小病毒的检测方法，该方法包括如下步骤：以单克隆抗体4C11作为包被抗体，铕Eu3+标记的单克隆抗体7D5作为检测抗体，建立了犬细小病毒的双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析检测方法。具体的说，本专利技术的一种犬细小病毒的检测方法，包括如下步骤：(1)固相包被抗体的制备单克隆抗体4C11于微孔板内用2μg/mL包被液(碳酸盐缓冲液，50mmol/L，pH9.6)包被，每孔100μL，4℃过夜，弃包被液，加封闭液(5％BSA的PBS溶液，pH7.4)，每孔250μL，37℃封闭2h，弃封闭液，用洗涤液(0.5％Tween-20的PBS溶液，pH7.4)洗涤3次，拍干，放于-20℃保存备用；(2)铕标记检测抗体及其纯化参考铕标记Eu3+试剂盒说明书对检测抗体7D5进行标记。取0.5mg检测抗体7D5，加入到带有滤膜的离心管中，8000×g离心8min；用标记缓冲液(50mmol/L，Na2CO3，pH9.0)重复洗涤6次；设置Eu3+标记试剂：标记抗体比例分别为70μL：30μL，60μL：40μL，50μL：50μL，40μL：60μL，30μL：70μL，25℃振荡过夜。标记完成后用Sephadex-G50层析分离纯化，用洗脱液(含50mmol/LTris-HCL的生理盐水)洗脱，收集流出液(1mL/管)，测定每管洗脱液的OD280值，并根据Eu3+标记试剂盒说明书所提供的公式计算标记率；(3)标准品的制备及标准曲线的绘制用含0.02％BSA，0.05％Proclin300，50mmol/L的Tris-HCL缓冲液(pH7.8)，将CPV抗原配制成浓度为0，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，80ng/mL，160ng/mL，640ng/mL的系列标准品溶液，采用BCA法测定CPV抗原浓度，每瓶1mL分装冻干，放-20℃保存备用；使用时分别加入1mL去离子水溶解使用；(4)TRFIA法检测犬细小病毒步骤取25μL标准品或待测样品，加入到包被好的微孔板中，再加入200μL分析缓冲液(8mmol/LNaCL，0.1％明胶，0.05％Proclin300，0.1％mL/LTween-80的Tris-HCL溶液，pH7.8)，25℃振荡孵育1h，弃掉上清液，用洗涤液(0.5％Tween-20的PBS溶液，pH7.4)洗涤3次，加入步骤(2)中制备得到的150μLEu3+标记的CPV抗体溶液，再加入100μL分析缓冲液(含0.2％BSA，0.9％NaCL，19.6mg/LDTPA，0.05％Proclin300，0.1％mL/LTween-20的Tris-HCL50mmol/L溶液，pH7.8)，混均25℃孵育1h，去除上清，洗涤液洗涤5次，加入200μL增强液(0.1％TritonX-100，3.99mg/Lβ-NTA，19.33mg/LTOPO，1.3g/L邻苯二甲酸氢钾，0.6％冰醋酸)，微孔板于干式荧光免疫分析仪上读取荧光值。本专利技术提供的犬细小病毒的检测方法(简称TRFIA法)是利用一株犬细小病毒的单克隆抗体(MAb)作为包被抗体，Eu3+标记的另一株MAb作为检测抗体，建立了犬细小病毒的双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析方法，为犬细小病毒的检测提供了一种新的技术手段。结果发现：灵敏度高，约为0.79ng/mL；各浓度CPV标准品在不同水平稀释度回收率为96.48％-105.17％；特异性强，同步检测CCV、CDV、CAV-1、CPIV标准品均为阴性；重复性好，批内和批间变异系数分别在4.78％-6.03％和4.23％-6.42％；稳定性好，4℃可保存6个月以上，37℃可保存7天以上。临床检测结果与PCR方法一致。本专利技术提供的检测方法具有灵敏度高，稳定性好，特异性强，重复性好，操作便捷，受本底因素影响少等优点，适用于CPV的快速检测，具有较高的临床实用价值和推广价值。附图说明图1CPV时间分辨免疫荧光技术的标准曲线具体实施方式材料来源：犬细小病毒单克隆抗体4C11(包被抗体，效价1∶150000)和7D5(检测抗体，效价1∶300000)均购买珠海博美生物科技有限公司；铕(Eu3+)标记试剂盒购自PerkinElmer公司；牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma-Aldrich公司；Sephadex-G50填料购自GE公司；微孔板购自Costar公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Sigma-Aldrich公司；细小病毒抗原快速检测试剂盒为Anigen；干式荧光免疫分析仪购买于苏州和迈精密仪器有限公司；60份疑似犬细小病毒的样本，20份犬细小病毒阴性粪便均由上海市农业科学院宠物医院提供。犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)、犬冠状病毒(Caninecoronavirus，CCV)、犬瘟热病毒(caninedistemper，CDV)、犬腺病毒I型(CanineadenovirustypeI，CAV-I)、犬副流感病毒(Canineparainfluenzavirus，CPIV)均由上海市农业科学院畜牧兽医研究所提供。实施例1检测犬细小病毒TRFIA法的建立和性能评估1.1固相包被抗体的制备单克隆抗体4C11用2μg/mL包被液(碳酸盐缓冲液，50mmol/L，pH9.6)包被，每孔100μL，4℃过夜，弃包被液，加封闭液(5％BSA的PBS溶液，pH7.4)，每孔250μL，37℃封闭2h，弃封闭液，用洗涤液(0.5％Tween-20的PBS溶液，pH7.4)洗涤3次，拍干，放于-20℃保存备用。1.2铕标记检测抗体及其纯化参考铕标记Eu3+试剂盒说明书对检测抗体7D5进行标记。取0.5mg检测抗体7D5，加入到带有滤膜的离心管中，8000×g离心8min。用标记缓冲液(50mmol/L，Na2CO3，pH9.0)重复洗涤6次。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬细小病毒的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：/n以单克隆抗体4C11作为包被抗体，铕Eu

【技术特征摘要】
1.一种犬细小病毒的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
以单克隆抗体4C11作为包被抗体，铕Eu3+标记的单克隆抗体7D5作为检测抗体，建立了犬细小病毒的双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析检测方法。


2.根据权利要求1所述的犬细小病毒的检测方法，包括如下步骤：
(1)固相包被抗体的制备单克隆抗体4C11于微孔板内用2μg/mL包被液，碳酸盐缓冲液，50mmol/L，pH9.6，包被，每孔100μL，4℃过夜，弃包被液，加封闭液，5％BSA的PBS溶液，pH7.4，每孔250μL，37℃封闭2h，弃封闭液，用洗涤液：0.5％Tween-20的PBS溶液，pH7.4，洗涤3次，拍干，放于-20℃保存备用；
(2)铕标记检测抗体及其纯化参考铕标记Eu3+试剂盒说明书对检测抗体7D5进行标记。取0.5mg检测抗体7D5，加入到带有滤膜的离心管中，8000×g离心8min；用标记缓冲液，50mmol/L，Na2CO3，pH9.0，重复洗涤6次；
设置Eu3+标记试剂：标记抗体比例分别为70μL：30μL，60μL：40μL，50μL：50μL，40μL：60μL，30μL：70μL，25℃振荡过夜；标记完成后用Sephadex-G50层析分离纯化，用含50mmol/LTris-HCL的生理盐水洗脱液洗脱，收集流出液，测定每管洗脱液的OD280值，并根据Eu3+标记试剂盒说明书所提供的公式计算标记率；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：易建中，李红，刘成倩，刘惠莉，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31