高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法，包括载体，所述载体上设有标记区、T位点和C位点，所述标记区固定干燥有信号粒子标记的SARS‑CoV‑2重组抗原，T位点包被有竞争性物质，所述竞争性物质为与信号粒子标记的SARS‑CoV‑2重组抗原特异性反应的受体蛋白，C位点包被有SARS‑CoV‑2重组抗体。本发明专利技术可减少中和抗体的抱团效应，增大竞争性物质的位阻效应，有利于中和抗体和SARS‑CoV‑2重组抗原的结合，提高检测灵敏度和准确度，测定的样本种类多，适应不同场合，操作方便，用户体验便捷。

【技术实现步骤摘要】
高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于免疫荧光检测
，尤其是涉及一种高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
血管紧张素转化酶2(AngiotensinConvertingEnzyme2，ACE2)是一种Ⅰ型跨膜蛋白，是SARS-CoV-2感染人体，进入细胞的重要靶点。SARS-CoV-2通过表面的S-蛋白与人上皮细胞的ACE2结合，侵入细胞后利用细胞内的物质进行复制繁衍，即新型冠状病毒S蛋白受体结合域(receptorbindingdomain，RBD)可与病毒与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合。当SARS-CoV-2在侵入机体时，会刺激机体产生具有保护作用的中和抗体，专门阻止病原微生物进入细胞，防止感染。中和抗体是由适应性免疫应答细胞分泌的一种可溶性蛋白，具有识别病毒表面蛋白、阻断其与细胞表面特异性受体结合的功能，从而发挥抗病毒作用。中和抗体的多少是疫苗免疫保护效果的一项重要指标，是疫苗评估和质控的重要依据。西湖大学研究团队发现AXL是新冠病毒感染人类呼吸系统的潜在受体，研究团队发现新冠病毒在人类呼吸系统中可能存在其他重要受体。研究团队证明肺细胞上的AXL蛋白与新冠病毒刺突蛋白相结合，并在细胞膜上存在强共定位。且与呼吸系统上皮细胞结合强度排名前三的候选受体分别为：AXL蛋白、EGFR蛋白和LDLR蛋白。目前已经建立的冠状病毒中和抗体检测方法有双抗原夹心法、间接法和竞争法。其中双抗原夹心法与间接法检测的是总抗体含量，不能针对性反应样本中的中和抗体含量。目前已公开专利中，竞争法检测中和抗体含量多为常规竞争的方式。例如，公告号为CN111781354B的已授权专利公开了新型冠状病毒中和性抗体滴度检测ELISA试剂盒。现有技术多为：标记抗原，包被受体蛋白，样本中的中和抗体与受体蛋白直接竞争抗原，通过结合的数量反应中和抗体的含量。该方法提供的主要为直接并同时竞争的内环境，存在的问题有：对于低滴度的中和抗体，竞争优势不显著，灵敏度较低，对于较高滴度的中和抗体，竞争梯度小，容易造成检测结果偏差大等问题。同时目前已知的免疫学检测中，中和抗体检测均为通过抗体浓度或数量的结合，反应中和抗体的浓度，同时现有技术多用于酶免、胶体金法等试剂盒的检测，采用微流控免疫荧光法实现快速检测，目前未见到。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于一是专利技术一种高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒(微流控法)，二是专利技术一种高灵敏度的新型冠状病毒中和抗体间接竞争检测方法，以克服现有的新冠中和抗体灵敏度低的问题，准确检测受试者体内的中和抗体含量，准确评估新冠疫苗的有效性。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，包括载体，所述载体上设有标记区、T位点和C位点，所述标记区固定干燥有信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原，T位点包被有竞争性物质，所述竞争性物质为与信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原特异性反应的受体蛋白，C位点包被有SARS-CoV-2重组抗体。优选的，所述SARS-CoV-2重组抗原包括S蛋白全长片段或S蛋白部分片段，优选S-RBD蛋白。新型冠状病毒入侵宿主是通过表面的S蛋白与宿主细胞结合，而最主要的功能位点是S蛋白上的受体结合域即S-RBD，S-RBD蛋白直接与中和抗体结合，亲和力更高。优选的，SARS-CoV-2重组抗原混合有具有高免疫原性的结构蛋白，所述结构蛋白包括新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白、M蛋白中的至少一种，混合方式为SARS-CoV-2重组抗原和结构蛋白混匀后与信号粒子进行标记、SARS-CoV-2重组抗原和结构蛋白分别与信号粒子标记后进行混匀、SARS-CoV-2重组抗原与信号粒子进行标记后再在其中直接添加结构蛋白中的一种。本专利技术在标记区混合添加新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白、M蛋白中的至少一种，样本中的中和抗体流经标记区会与添加的N蛋白、E蛋白、M蛋白结合，有利于消耗高浓度样本中的中和抗体，使得检测试剂的高区线性梯度较好，扩大检测范围。优选的，所述SARS-CoV-2重组抗原的标记浓度为0.5-2mg/mL，结构蛋白的浓度为1-3mg/mL。优选的，所述竞争性物质为ACE2蛋白、AXL蛋白、EGFR蛋白、LDLR蛋白的至少一种，优选ACE2蛋白或AXL蛋白，标记浓度优选0.05-0.5mg/ml。ACE2是SARS-CoV-2感染人体，进入细胞的重要靶点，且AXL是新冠病毒感染人类呼吸系统的潜在受体，均能与S-RBD蛋白有很高的结合强度。优选的，所述竞争性物质包被到T位点的方式有以下两种：A、通过生物素化的受体蛋白抗体将受体蛋白包被在微流控芯片上，即形成亲合素/链霉亲合素-受体蛋白抗体-受体蛋白偶联物，受体蛋白抗体的浓度为5-50μg/mL，受体蛋白的浓度为2-40μg/mL；B、通过生物素-亲合素/链霉亲合素系统将受体蛋白包被在基片上，即形成亲合素/链霉亲合素-生物素-亲合素/链霉亲合素-受体蛋白。本专利技术T位点采用生物素化的抗体-抗原偶联物或亲合素/链霉亲合素-生物素系统将受体蛋白间接包被至基片上，可增大SARS-CoV-2重组抗原与受体蛋白结合的空间位阻效应，有利于中和抗体与SARS-CoV-2重组抗原的结合，放大信号，提高灵敏度。优选的，所述信号粒子包括荧光粒子、磁微粒、乳胶微粒的至少一种，其中荧光粒子包括荧光素填充微球、时间分辨荧光微球、量子点荧光微球的至少一种，所述信号粒子粒径在100-1000nm范围内。优选的，所述SARS-CoV-2重组抗体为生物素化的S-RBD抗体，浓度为2-80μg/mL，所述检测区T位点和C位点预先包被有亲合素/链霉亲和素，亲合素/链霉亲和素的浓度为5mg/mL。优选的，所述载体包括微流控芯片或层析试纸，所述试剂盒的样本为血液样本，所述血液样本为指尖血、静脉血、血清或血浆，加样量为30-40μL。检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片，微流控芯片包括固定连接的基片和盖片，微流控芯片沿样本流动方向分别设有加样孔、标记区、检测区和废液槽。样本经加样孔流经标记区后与信号粒子标记物结合后进入检测区发生免疫反应，最终流入废液槽后终止反应。样本经加样孔流经微通道至废液槽后反应终止，反应时间为2-4min。本专利技术的另一目的在于提供高灵敏的新型冠状病毒中和性抗体免疫荧光检测方法，包括以下步骤：S1：使血液样本流经固定干燥有信号粒子标记的消耗性物质的区域，所述消耗性物质为SARS-CoV-2重组抗原和/或结构蛋白，所述结构蛋白包括新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白、M蛋白中的至少一种，血液样本中的一部分中和抗体与消耗性物质偶联形成中和抗体-消耗性物质-信号粒子；S2：使S1得到的血液样本流经包被有竞争性物质的T检测区，其中，所述竞争性物质为与信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原特异性反应的受体蛋白，未结合中和抗体的信号粒子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：包括载体，所述载体上设有标记区、T位点和C位点，所述标记区固定干燥有信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原，T位点包被有竞争性物质，所述竞争性物质为与信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原特异性反应的受体蛋白，C位点包被有SARS-CoV-2重组抗体。/n

【技术特征摘要】
1.高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：包括载体，所述载体上设有标记区、T位点和C位点，所述标记区固定干燥有信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原，T位点包被有竞争性物质，所述竞争性物质为与信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原特异性反应的受体蛋白，C位点包被有SARS-CoV-2重组抗体。


2.根据权利要求1所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述SARS-CoV-2重组抗原包括S蛋白全长片段或S蛋白部分片段，优选S-RBD蛋白。


3.根据权利要求1或2所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述SARS-CoV-2重组抗原混合有具有高免疫原性的结构蛋白，所述结构蛋白包括新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白、M蛋白中的至少一种，混合方式为SARS-CoV-2重组抗原和结构蛋白混匀后与信号粒子进行标记、SARS-CoV-2重组抗原和结构蛋白分别与信号粒子标记后进行混匀、SARS-CoV-2重组抗原与信号粒子进行标记后再在其中直接添加结构蛋白中的一种。


4.根据权利要求3所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述SARS-CoV-2重组抗原的标记浓度为0.5-2mg/mL，结构蛋白的浓度为1-3mg/mL。


5.根据权利要求1或2所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述竞争性物质包括ACE2蛋白、AXL蛋白、EGFR蛋白、LDLR蛋白的至少一种，优选ACE2蛋白或AXL蛋白，标记浓度优选0.05-0.5mg/ml。


6.根据权利要求1或2所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述竞争性物质包被到T位点的方式有以下两种：
A、通过生物素化的受体蛋白抗体将受体蛋白包被在微流控芯片上，即形成亲合素/链霉亲合素-受体蛋白抗体-受体蛋白偶联物，受体蛋白抗体的浓度为5-50μg/mL，受体蛋白的浓度为2-40μg/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，周洪锐，魏华英，李昀地，刘钟泉，赵娜，张粲，王俊水，肖福磊，李轩，秦月，贾凌云，贺敬文，刘陈针玉，钱龙，李娜，孟佳，李洲，
申请(专利权)人：天津中新科炬生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12