一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒和检测方法以及应用技术

本发明专利技术提供了一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒和检测方法以及应用，属于生物技术领域。为了有效的提高传染性支气管炎病毒检测的灵敏度、特异性和总符合率。本发明专利技术一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒和方法，用纯化的单克隆抗体4F10株作为固相抗体结合在固相载体表面，单克隆抗体6H3株作为酶标抗体，建立一种能够快速检测传染性支气管炎病毒抗原的双抗夹心ELISA方法。该方法简便、特异、敏感、准确率高，能够在实际生产中快速诊断鸡群是否感染鸡传染性支气管炎病毒，为该病的免疫防控提供依据。

【技术实现步骤摘要】
一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒和检测方法以及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒和检测方法以及应用。
技术介绍
鸡传染性支气管炎(InfectiousBronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起鸡的一种急性、高度接触传染性呼吸道传染病，本病呈世界性分布，是严重危害养禽业的最主要疫病之一。传染性支气管炎感染鸡后，病毒原发和主要的增殖部位为呼吸道上皮细胞，因此该病初期发病的主要特征是病鸡咳嗽、打喷嚏、气管啰音。随着病程的发展，病毒进一步呈现出更加广泛的组织嗜性，但不同病毒株往往呈现出不同的致病性。根据IBV感染后期病毒对组织的亲嗜性、损害的主要器官，将该病分为不同的致病型，主要包括呼吸道致病型、肾脏病变型、肠病变型、生殖道病变型等，可见传染性支气管炎具有多种不同组织嗜性和致病特点，在临床上经常与其他疾病相混淆，仅依据临床和组织学变化对传染性支气管炎作出客观判断存在很大难度，这便对准确判定病原因造成巨大障碍，也便对疫病的有效防控造成困难。因此，实验室病原学检测在疫病的确诊过程中起着重要的作用。目前实验室常用的病原学检测方法包括病毒分离和鉴定、RT-PCR法鉴定、RT-qPCR法以及核酸探针法，其中病毒分离和鉴定方法是准确鉴定鸡传染性支气管炎病毒的方法，也是病原学诊断该病的金标准，但该方法费时费力，成本较高，严重阻碍该方法在生产实践中的应用。而RT-PCR法鉴定、RT-qPCR法虽然具有敏感、快速检测病原核酸的特点，但对于操作人员的技术要求较高，容易在实验操作中造成假阳性，因此也不在临床上推广应用。核酸探针法虽然检测快速，但敏感性显著低于其他方法，这也限制了该方法在实践中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了有效的提高传染性支气管炎病毒检测的灵敏度、特异性和总符合率，本专利技术提供一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒，所述双抗夹心ELISA检测试剂盒包括以下成分：固相结合单克隆抗体4F10和酶标单克隆抗体6H3。进一步地限定，所述固相结合抗体4F10和酶标抗体6H3的浓度为5μg/ml。进一步地限定，所述夹心ELISA检测试剂盒还包括10×PBST浓缩洗涤液、10×样品稀释液、底物显色液、终止液、封闭液、标准阳性对照、标准阴性对照和HRP标记的单克隆抗体。进一步地限定，所述PBST浓缩洗涤液为体积分数为1％-5％Tween-20、质量体积比为8％(mg/mL)氯化钠、质量体积比为0.2％(mg/mL)氯化钾、质量体积比为3％(mg/mL)磷酸氢二钠和质量体积比为0.2％(mg/mL)磷酸二氢钾的水溶液，pH＝7.4；所述10×样品稀释液为上述10×PBST浓缩洗涤液加入体积分数为1％Triton-X100的溶液，pH＝7.4；所述底物显色液的成分为10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺磷酸缓冲溶液；所述封闭液为质量体积比为1％-5％(mg/mL)BSA。进一步地限定，所述标准阳性对照为OD630吸光值在0.1-0.8之间的传染性支气管炎病毒抗原阳性稀释液；所述标准阴性对照为OD630吸光值在0.03-0.1之间的传染性支气管炎病毒抗原阴性稀释液。上述的传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒在制备诊断传染性支气管炎病毒试剂中的应用。本专利技术还提供了一种非诊断目的检测传染性支气管炎病毒的方法，所述方法的步骤如下：(1)将酶标单克隆抗体6H3加入到固定了单克隆抗体4F10的96孔酶联反应板中，加入酶标单克隆抗体6H3100μl/孔，置4℃下作用12小时；(2)然后加入洗涤液，250μl/孔，洗涤3次；(3)然后加入封闭液，200μl/孔，置37℃下封闭2小时，再加入洗涤液，250μl/孔，洗涤3次；(4)然后用样品稀释液将IBV抗原标准品进行相应稀释，100μl/孔，置37℃温箱孵育60分钟，加入洗涤液，250μl/孔，洗涤3次；(5)然后加入HRP标记的单克隆抗体，100μl/孔，置37℃温箱孵育60分钟，加入洗涤液，250μl/孔，洗涤3次；(6)然后加入显色液，100μl/孔，置室温避光孵育30分钟；(7)最后加入终止液，100μl/孔，在630nm的波长下读数，并记录结果。有益效果：本专利技术利用优选的单克隆抗体4F10株和6H3株分别作为固相结合抗体和酶标抗体，建立一种简便、特异的双抗夹心ELISA方法。本专利技术还为检测鸡传染性支气管炎病毒抗原提供了特异、敏感、快速、操作简便的试剂组合，能够在实际生产中快速诊断鸡群样本是否感染鸡传染性支气管炎病毒，为准确诊断鸡群是否感染传染性支气管炎病毒提供依据，为传染性支气管炎疫病的有效防控提供参考。附图说明图1为37℃、0.5mmol/LIPTG诱导条件下N-GST融合蛋白的表达分析；其中，M是蛋白质标准分子量；1是未诱导阳性菌；2是诱导后菌体；3是诱导2h后菌体上清；4是诱导3h后菌体上清；5是诱导4h后菌体上清；6是诱导5h后菌体上清；7是诱导6h后菌体上清；图2为N-GST融合蛋白纯化结果；其中，M是蛋白质标准分子量，1是诱导后菌体上清；2是过柱流穿液；3是过柱流穿液；4是WashBuffer洗脱；5是ElutionBuffer第一次洗脱；6是ElutionBuffer第二次洗脱；图3为4种单克隆抗体纯化后结果；其中，M是蛋白质标准分子量，1是单克隆抗体2D2株；2是单克隆抗体4F10株；3是单克隆抗体6D10株；4是单克隆抗体6H3株。具体实施例IBV毒株为tl/CH/LDT3/03株记载在Han,Z.,Zhang,T.,Xu,Q.,Gao,M.,Chen,Y.,Wang,Q.,Zhao,Y.,,Y.,Li,H.,Kong,X.andLiu,S.Alteredpathogenicityofatl/CH/LDT3/03genotypeinfectiousbronchitiscoronavirusduetonaturalrecombinationinthe5′-17kbregionofthegenome.VirusRes.2016Feb2；213:140–148.)克隆载体pMD18-Tvector(购自TaKaRa公司)，表达载体为pET-30a和pGEX-6p-1(购自Novagen公司)。实施例1.一、固相结合抗体和酶标抗体的制备1.重组N蛋白的表达、鉴定与纯化通过对IBVtl/CH/LDT3/03毒株N蛋白基因序列的分析(GenebankID：KT852992)，先利用Trizol方法提取IBVtl/CH/LDT3/03毒株的总RNA，利用One-stepRT-PCR进行反转录，引物如下：NF:5'-CGCGGATCCATGGCGAGCGGTAAAGCAAC-3'，序列如SEQIDNO.1所示。NR:5'-GCGTCG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述双抗夹心ELISA检测试剂盒包括以下成分：固相结合单克隆抗体4F10和酶标单克隆抗体6H3。/n

【技术特征摘要】
1.一种传染性支气管炎病毒的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述双抗夹心ELISA检测试剂盒包括以下成分：固相结合单克隆抗体4F10和酶标单克隆抗体6H3。


2.根据权利要求1所述的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述固相结合抗体4F10和酶标抗体6H3的浓度为5μg/ml。


3.根据权利要求1所述的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述夹心ELISA检测试剂盒还包括10×PBST浓缩洗涤液、10×样品稀释液、底物显色液、终止液、封闭液、标准阳性对照、标准阴性对照和HRP标记的单克隆抗体。


4.根据权利要求3所述的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述PBST浓缩洗涤液为体积分数为1％-5％Tween-20、质量体积比为8％(mg/mL)氯化钠、质量体积比为0.2％(mg/mL)氯化钾、质量体积比为3％(mg/mL)磷酸氢二钠和质量体积比为0.2％(mg/mL)磷酸二氢钾的水溶液，pH＝7.4；所述10×样品稀释液为上述10×PBST浓缩洗涤液加入体积分数为1％Triton-X100的溶液，pH＝7.4；所述底物显色液的成分为10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺磷酸缓冲溶液；所述封闭液为质量体积比为1％-5％(mg/mL)BSA。


5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘胜旺，张宇，韩宗玺，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23