一种基于σ因子作为转录元件的无细胞蛋白质合成方法技术

本申请提供了一种基于细胞内源σ因子的，用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法，其特征在于：所述方法利用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌内源的σ因子以及对应的启动子组成的蛋白表达基因元件在无细胞蛋白合成体系中进行蛋白质表达。表达。表达。

【技术实现步骤摘要】
一种基于
σ
因子作为转录元件的无细胞蛋白质合成方法


[0001]本专利技术属于合成生物学蛋白合成领域，具体涉及一种用于无细胞蛋白质合成表达元件的方法。

技术介绍

[0002]在过去的几十年中，随着代谢工程和合成生物学的发展，微生物作为生产多种多样的(生物)化学品生产工厂，展现出巨大的潜力和应用前景。而无细胞蛋白合成(cell
‑
free protein synthesis，CFPS)是一种新型的蛋白合成技术，在生物类产品生产上相比于全细胞工厂有着其合成的优势。这种技术主要是利用细胞提取物中转录翻译相关的催化酶组分联合外添加的能量再生系统，蛋白合成氨基酸底物，无机盐和辅因子等进行体外的蛋白质合成。无细胞合成能够在体外完成蛋白合成过程，而不需要活细胞的参与。因为没有细胞膜的限制，这个合成体系更加可控制，可以外添加特定试剂辅助蛋白的合成，例如通过调整氧化还原化合物的比例来促进二硫键的合成，添加表面活性剂及纳米圆盘等协助膜蛋白的合成，添加非天然氨基酸为蛋白进入特定的基团等。除此之外，无细胞体系的DNA模板不受限于环形的表达质粒或者基因组，纯化的线性DNA产物亦能在无细胞体系中有较高的表达效率。另外，无细胞体系中由于不涉及细胞生长，可以表达毒性蛋白。基于以上无细胞系统的优势，近年来有许多合成生物学相关应用被开发，包括传感器，药物制造，大分子生产，能源与储能，生物材料及人工细胞等技术。
[0003]尽管无细胞蛋白合成体系已发展六十余年，但是其可用的基因元件仍十分匮乏，主要是依赖噬菌体T7及T7 RNA聚合酶在体系中进行转录翻译。有限的噬菌体转录元件限制了无细胞体系中基因电路的开发及复杂体系的应用。近几年有相关研究利用大肠杆菌σ因子开发可用于无细胞蛋白合成体系的表达元件。此研究证明了内源性的表达元件在无细胞中的应用潜力。基于σ因子的表达系统主要是细胞内一类可以与核心酶结合形成聚合酶全酶后识别启动子中保守序列的转录因子，而启动子中非保守序列则会影响表达强度。在自然界中，σ因子及其启动子组成了庞大的转录元件库。而基于细胞提取物的无细胞体系中由于保留了大部分细胞中转录翻译的酶组分体系，在细胞提取物中便有足够的核心酶等转录元件。因此多种σ因子及其不同强度的启动子可以被发开利用在无细胞体系中。另外除了大肠杆菌中有σ因子系统，某些革兰氏阳性菌例如枯草芽孢杆菌，或革兰氏阴性菌谷棒杆菌中也有此转录系统。并且在物种间的核心酶功能口袋具有保守型，因此其余物种的σ因子仍适用于大肠杆菌无细胞体系。

技术实现思路

[0004]尽管已经有研究开发了基于σ因子的转录元件用于无细胞体系，但此开发仍是有限的，仍不能满足无细胞体系面对不同调控的需求。另外对于调控型的表达，调控元件与被调控元件之间需要有较好的正交性，即一个启动子只能被一种转录因子调控表达。因此需要开发更多的可用于无细胞体系并具有正交性表达元件。而自然界中的σ因子及其启动子
仍有许多元件及在无细胞中的应用仍未被挖掘。表达调控元件在调控与被调控之间需要背景低以及调控专一性强等特点，所以外源枯草芽孢杆菌的元件库也是其中一种选择。
[0005]另外为了节省DNA模板设计构建的时间，使得无细胞体系更加适用于基因电路的设计及筛选工作，在无细胞中可以利用PCR纯化后的线性DNA作为模板进行蛋白表达与筛选。由于没有质粒构建过程，不仅仅减少设计构建时间，还可以避免σ因子在构建过程中的表达而影响宿主细胞大肠杆菌生长的问题。
[0006]本专利技术提供一种基于细胞内源σ因子用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法。在细胞里σ因子结合核心酶形成RNA聚合酶全酶能够使有特定序列的启动子启动转录过程，该方法主要使用内源组成型启动子P70在无细胞体系中表达具有正交性的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌σ因子后，结合了核心酶的σ因子与其对应启动子组成无细胞蛋白合成体系的转录元件，在无细胞蛋白合成的过程中担任转录的功能，并且此翻译转录元件以线性PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)产物的形式进行添加使用。本转录翻译体系利用内源转录元件而不受限于有限的噬菌体T7启动子和T7 RNA聚合酶。不同的σ因子及其启动特异性可实现对蛋白表达的多元控制。另外使用线性PCR产物使得基因元件设计更加灵活以及省去质粒构建时间。基于内源性σ因子的表达元件应用使得无细胞合成体系能够灵活应用在更加复杂的生物系统中，例如合成基因电路设计及功能验证，附加值生物产品的生产以及人工细胞等。
[0007]具体地：
[0008]一方面，本申请提供了一种基于细胞内源σ因子的，用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法，其特征在于：所述方法利用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌内源的σ因子以及对应的启动子组成的蛋白表达基因元件在无细胞蛋白合成体系中进行蛋白质表达。
[0009]进一步地，所述方法中σ因子表达DNA模板及启动子与目的蛋白DNA模板以线性PCR产物形式添加到无细胞蛋白合成体系中进行蛋白表达。
[0010]进一步地，所述方法中所使用的无细胞蛋白合成体系为基于大肠杆菌细胞提取物的无细胞体系。
[0011]进一步地，所述方法中的σ因子选自大肠杆菌σ因子σ
24
、σ
28
、σ
32
、σ
38
、σ
54
、σ
70
、枯草芽孢杆菌σ因子σ
A
、σ
B
、σ
D
、σ
E
、σ
F
、σ
G
、σ
H
、σ
K
、σ
W
、σ
X
和/或σ
L
。
[0012]进一步地、启动子为能够被σ因子特定识别并且启动转录的大肠杆菌调控型启动子P
24a
、P
24b
、P
24c
、P
24d
、P
28d
、P
32a
、P
32b
、P
32c
、P
32d
、枯草芽孢杆菌调控型启动子P
Bb
、P
Bc
、P
Be
、P
Da
、P
Db
、P
Dc
、P
Ea
、P
Eb
、P
Ec
、P
Fd
、P
Fe
、P
Gc
、P
Gd
、P
Hd
，或者不需要添加转录因子即可进行蛋白转录的组成型启动子P
70f
、P
Ac
、P
He
。
[0013]进一步地，所述方法中利用组成型启动子P70表达σ因子，σ因子与对应序列的启动子特异识别并且启动转录的过程。
[0014]另一方面，本申请提供了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞内源σ因子的，用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法，其特征在于：所述方法利用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌内源的σ因子以及对应的启动子组成的蛋白表达基因元件在无细胞蛋白合成体系中进行蛋白质表达。2.根据权利要求1所述的方法，其中σ因子表达DNA模板及启动子与目的蛋白DNA模板以线性PCR产物形式添加到无细胞蛋白合成体系中进行蛋白表达。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法中所使用的无细胞蛋白合成体系为基于大肠杆菌细胞提取物的无细胞体系。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其中的σ因子选自大肠杆菌σ因子σ
24
、σ
28
、σ
32
、σ
38
、σ
54
、σ
70
、枯草芽孢杆菌σ因子σ
A
、σ
B
、σ
D
、σ
E
、σ
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、σ
G
、σ
H
、σ
K
、σ
W
、σ
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和/或σ
L
。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其中启动子为能够被σ因子特定识别并且启动转录的大肠杆菌调控型启动子P
24a
、P
24b
、P
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、P
24d
、P
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、P
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、P
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、P
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、P
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、枯草芽孢杆菌调控型启动子P
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、P
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、P
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、P
Dc
、P
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Gd
、P
Hd
，或者不需要添加转录因子即可进行蛋白转录的组成型启动子P
70...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢元，林晓媚，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：