一种氧气响应型生物传感器的构建与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种氧气响应型生物传感器的构建与应用，属于合成生物学领域。本发明专利技术以富马酸硝酸盐还原酶FNR和含有FNR靶向结合位点的启动子P

【技术实现步骤摘要】
一种氧气响应型生物传感器的构建与应用


[0001]本专利技术涉及一种氧气响应型生物传感器的构建与应用，属于合成生物学领域。

技术介绍

[0002]利用微生物细胞工厂进行化合物的合成通常涉及利用代谢工程的方法来提高目标代谢流的通量，传统的代谢工程多为静态的不可逆的改变，如基因的过表达与敲除等，此方法不能很好地适应细胞内和细胞外条件的变化进而平衡代谢流在生长与生产之间的分布，这会潜在地影响细胞的生长或目标化合物的生产。细胞内生物传感器的发展与应用缓解了传统方法所面临的的难题，其可以实时监测细胞内外环境变化并将环境信号转换为基因表达信号，从而动态平衡细胞生长和生产之间的代谢流分布。三类主要的细胞内生物传感器分别为：基于共振能量转移的生物传感器，基于转录调节因子的生物传感器和基于核糖体开关的生物传感器。其中，基于转录调节因子的生物传感器和基于核糖体开关的生物传感器被广泛地应用于代谢流的动态调控。以基于转录调节因子的生物传感器为例，根据转录调节因子的类型可分为两类：(1)激活剂调节模型，当转录激活因子被激活并与启动子区域结合时发生转录，从而激活靶基因表达；(2)抑制剂调节模型，当转录阻遏因子被激活并与启动子区域结合时，转录被抑制，从而抑制靶基因表达。
[0003]有研究分析表明，当微生物细胞从有氧生长状态向厌氧生长状态的转变时，有氧条件生长过程中表达的基因中，超过三分之一的基因的表达会发生变化，除此之外，厌氧条件的氧气限制会由于呼吸活性减弱或产生抑制性副产物而对细胞的生长和生产力产生影响。为更好地平衡菌株随发酵环境氧气变化而出现的代谢转换，氧气响应型生物传感器被开发用来调节与碳流和能量流相关的中心代谢途径。丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)响应的大肠杆菌天然启动子P
pfl
，硝酸还原酶(NAR)响应的大肠杆菌天然启动子P
nar
，透明颤菌血红蛋白响应的启动子P
vgb
和利用计算机设计及文库构建获得的P
fnrF8
合成启动子等均被报道为具有优异性能的合成和天然氧气响应型启动子，以这些启动子元件构建的氧气响应型生物传感器均为厌氧诱导型生物传感器，即厌氧生长条件下，其调控的参与厌氧呼吸和发酵的基因表达增强，而参与有氧呼吸和三羧酸循环的基因表达被抑制。迄今为止，研究最多的氧气响应型生物传感器是富马酸酯和硝酸盐还原酶(FNR)转录激活因子依赖的厌氧诱导型生物传感器。

技术实现思路

[0004]技术问题：
[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供一种氧气响应型生物传感器，能使细胞在生长和生产之间达到动态平衡。
[0006]技术方案：
[0007]所述氧气响应型生物传感器，是以氧气响应的转录调控蛋白富马酸硝酸盐还原蛋白FNR为基础构建的反馈响应系统，当环境中氧气水平降低或无氧气时，FNR二聚体诱导下
游目的基因的表达。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种氧气响应型生物传感器，含有启动子P
ffs
、P
fnrF8
、FNR基因、FNR基因结合位点；所述P
ffs
调控FNR的表达；所述P
fnrF8
上整合FNR基因结合位点的序列，并调控下游目的基因的表达；所述启动子P
ffs
和启动子P
fnrF8
转录方向相反。
[0009]在一种实施方式中，所述生物传感器还含有启动子P
c
和其调控表达的抗性基因。
[0010]在一种实施方式中，启动子P
ffs
、P
fnrF8
、P
c
、FNR基因、FNR基因结合位点和抗性基因位于质粒上。
[0011]在一种实施方式中，所述载体为pACM4G。
[0012]在一种实施方式中，所述载体pACM4G是以pACM4为模板，全质粒PCR，将CmR基因替换为GmR基因。
[0013]在一种实施方式中，所述抗性基因为庆大霉素抗性基因GmR。
[0014]在一种实施方式中，所述生物传感器FNR基因结合位点的序列与启动子P
fnrF8
的
‑
35区之间距离为0～27bp。
[0015]在一种实施方式中，编码所述启动子P
ffs
的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述启动子P
c
的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述启动子P
fnrF8
的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码所述FNR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述FNR结合位点的核苷酸序列为TTGA(T/C)NNNN(A/G)TCAA；所述抗性基因GmR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0016]在一种实施方式中，所述生物传感器的目的基因是编码琥珀酰辅酶A合成酶α亚基的基因sucD、编码富马酸还原酶的基因frdABCD和编码丙酮酸羧化酶的基因pyc。
[0017]本专利技术的第二个目的是提供含有所述生物传感器的基因工程菌。
[0018]本专利技术的第三个目的是提供一种构建氧气响应型生物传感器的方法，其具体步骤如下：克隆大肠杆菌(Escherichia coli)K12 MG1655的FNR基因，质粒pGRT
‑
ffs的启动子P
ffs
，合成启动子P
fnrF8
，连接到载体pACM4G上，获得生物传感器质粒；所述P
ffs
调控FNR的表达；所述P
fnrF8
上整合FNR基因结合位点的序列，并调控下游目的基因的表达；所述启动子P
ffs
和启动子P
fnrF8
转录方向相反。
[0019]本专利技术的第四个目的是提供一种构建不同厌氧诱导强度的启动子的方法。
[0020]在一种实施方式中，在FNR结合位点与启动子P
fnrF8
的
‑
35区之间增加10～20bp的距离获得具有不同厌氧诱导强度的启动子。
[0021]在一种实施方式中，在FNR结合位点与启动子P
fnrF8
的
‑
35区之间缩短3～7bp的距离获得具有不同厌氧诱导强度的启动子。
[0022]本专利技术的第五个目的是提供一种不同厌氧诱导强度的启动子。
[0023]在一种实施方式中，所述启动子的FNR基因结合位点的序列与启动子P
fnrF8
的
‑
35区之间距离为0～27bp。
[0024]在一种实施方式中，所述启动子的FNR基因结合位点的序列与启动子P
fnrF8
的
‑
35区之间距离为0～7bp。
[0025]本专利技术的第六个目的是提供一种构建不同厌氧诱导强度的生物传感器的方法，所述方法包括以下步骤：
[0026]1)克隆大肠杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物传感器，其特征在于，含有启动子P
ffs
、P
fnrF8
、FNR基因、FNR基因结合位点；所述P
ffs
调控FNR的表达；所述P
fnrF8
上整合FNR基因结合位点的序列，并调控下游目的基因的表达；所述启动子P
ffs
和启动子P
fnrF
8转录方向相反。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，还含有启动子P
c
和其调控表达的抗性基因。3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，启动子P
ffs
、P
fnrF8
、P
c
，FNR基因、FNR基因结合位点和抗性基因位于质粒上。4.根据权利要求3所述的生物传感器，其特征在于，所述载体为pACM4G；所述pACM4G是以pACM4为模板，将氯霉素抗性基因CmR替换为庆大霉素抗性基因GmR。5.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器FNR基因结合位点的序列与启动子P
fnrF8
的<...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，周胜虎，郝婷婷，毛银，赵运英，李国辉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：