本发明专利技术涉及一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法；其主要包括构建shTNFR2的重组表达载体、转化大肠杆菌获得重组菌实现原核表达、菌体裂解获得包涵体沉淀、包涵体沉淀的洗涤和蛋白变性处理、稀释复性处理以及纯化处理；其中，在构建重组表达载体步骤中，采用特定的引物扩增shTNFR2全长蛋白的基因片段，面对随之带来的纯化操作中的困难，发明专利技术人做了大量的优化，发现在蛋白变性处理后，依次加入DTT和氧化型谷胱甘肽至特定浓度，对变性蛋白先后进行还原和氧化处理；在此基础之上，稀释复性步骤中，采用特定pH值和盐浓度的复性缓冲液进行复性处理，最终获得的纯化后的shTNFR2蛋白具有高纯度和较强的生物学活性。性。性。
【技术实现步骤摘要】
一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法
[0001]本专利技术涉及一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法，属于生物
技术介绍
[0002]人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体(human tumor necrosis factor receptor typeⅡ，hTNFR2)是TNF受体超家族的重要成员之一，它和hTNFR1都是TNF
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α(或TNF
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β)的受体。TNF
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α通过与hTNFR1/hTNFR2的特异性结合参与免疫调节、炎症、凋亡和自身免疫等生理和病理过程。
[0003]hTNFR1和hTNFR2都是Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜段和胞内段构成。hTNFR2的胞内段没有死亡结构域，它在与TNF结合后大多数情况下通过激活非经典的促存活NF
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κB信号通路来调控细胞的存活和修复过程。
[0004]近年来研究发现，hTNFR2高表达于某些癌细胞表面并可促进其增长，如卵巢癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和皮肤非霍奇金淋巴瘤等。同时，hTNFR2亦在肿瘤微环境中富集的CD4+FoxP3+免疫抑制调节性T细胞(Treg)表面异常表达，通过TNF刺激传递的信号增加Treg的扩张性、稳定性和功能，抑制抗肿瘤免疫反应，是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。因此，hTNFR2正逐渐成为许多肿瘤免疫治疗的重要靶点，针对hTNFR2+肿瘤开发靶向hTNFR2的抗体或小分子拮抗剂越来越受到人们的关注。(参考文献：H.Torrey,J.Butterworth,T.Mera,Y.Okubo,L.Wang,D.Baum,A.Defusco,S.Plager,S.Warden,D.Huang,E.Vanamee,R.Foster,D.L.Faustman.Targeting TNFR2 with antagonistic antibodies inhibits proliferation of ovarian cancer cells and tumor
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associated Tregs.Science signaling.2017,10)
[0005]hTNFR的胞外区是与TNF结合的区域，研究发现，hTNFR胞外段在体内可被酶解剪切而游离分泌出去，形成可溶性的hTNFR(shTNFR，Soluble human tumor necrosis factor receptor)，shTNFR能够中和体液中的过量TNF
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α，抑制和局限TNF
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α的活性，在细胞因子网络中有重要的调节作用，例如，一定浓度的shTNFR可以减轻关节炎等疾病的局部炎症(参考文献：Gatto B.Biologics targeted at TNF:design,production and challenges.Reumatismo.2006,58:94
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103)。
[0006]可以看出，无论是作为肿瘤免疫治疗的药物靶点，还是用于开发治疗TNF
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α相关炎症性疾病的大分子生物制剂，在医药实验室和工业上都需要制备大量的shTNFR2蛋白。
[0007]现有技术中，shTNFR2蛋白的制备主要采用真核表达系统(如CHO细胞)，但需要耗费大量昂贵的哺乳动物细胞培养基，生长条件复杂，蛋白表达量低，生产周期也较长。由此，本领域技术人员希望能够采用成本更低、操作更为简便快捷的原核表达系统来制备shTNFR2蛋白；但具体到shTNFR2蛋白，若采用现有的原核表达系统来制备，后续的提取和纯化过程存在很大的技术困难，不仅蛋白的提取量很低，并且提取出来的蛋白的纯度和生物学活性均很低，没有实际的应用价值。
[0008]因此，亟待开发出新的可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白(shTNFR2蛋白)的制备方法，采用原核表达系统对shTNFR2全长蛋白进行重组表达，能够获得更高纯度和生物学活性的shTNFR2蛋白。
技术实现思路
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术一方面提供了一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法，其中，
[0010]该制备方法包括以下步骤：
[0011]步骤1)：构建可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白shTNFR2的重组表达载体；
[0012]步骤2)：将步骤1)获得的所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得重组菌，并诱导所述重组菌的蛋白表达；
[0013]步骤3)：收集步骤2)获得的经诱导表达的重组菌，经菌体裂解处理后，获得包涵体沉淀；
[0014]步骤4)：对步骤3)获得的所述包涵体沉淀依次进行洗涤处理和蛋白变性处理，获得shTNFR2变性蛋白液；
[0015]步骤5)：将步骤4)获得的所述shTNFR2蛋白变性液进行稀释复性处理获得复性蛋白液；
[0016]步骤6)：对步骤5)获得的所述复性蛋白液进行纯化处理获得所述shTNFR2蛋白；
[0017]其中，所述步骤1)中，采用PCR扩增shTNFR2基因片段；所使用的PCR上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；
[0018]所述步骤4)中，所述包涵体沉淀依次进行洗涤处理和蛋白变性处理后，再加入DTT至终浓度20～30mM，充分搅拌40
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60min，之后再加入氧化型谷胱甘肽至终浓度30～40mM，充分搅拌40
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60min，离心收集上清液，获得所述的shTNFR2变性蛋白液；
[0019]所述步骤5)中，所述稀释复性处理所使用的复性缓冲液的pH值为10.0～10.5，盐浓度为20～50mmol/L，稀释比例为1:50～1:100。
[0020]优选的，所述步骤4)中，所述蛋白变性处理所使用的变性缓冲液的pH值为8～8.5，其含有50～100mmol/L Tris
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HCl、6mol/L Gua
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HCl、5
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10mmol/L EDTA和1～2mmol/L PMSF。
[0021]优选的，所述复性缓冲液含有20～50mmol/L Tris
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HCl、20～50mmol/L NaCl、0.5～1mmol/L GSH、1～2mmol/L PMSF和1～2mmol/L EDTA。
[0022]优选的，所述步骤4)中，对所述包涵体沉淀的洗涤处理的过程为：采用第一洗涤缓冲液洗涤3
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4次，再采用第二洗涤缓冲液洗涤1次；
[0023]第一洗涤缓冲液的pH为7～8，含有20～50mmol/L Tris
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HCl、150～300mmol/L NaCl、1～5mmol/L EDTA、1mmol/L DTT和0.5vol％Triton X
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100；
[0024]第二洗涤缓冲液的pH为7～8，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：步骤1)：构建可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白shTNFR2的重组表达载体；步骤2)：将步骤1)获得的所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得重组菌，并诱导所述重组菌的蛋白表达；步骤3)：收集步骤2)获得的经诱导表达的重组菌，经菌体裂解处理后，获得包涵体沉淀；步骤4)：对步骤3)获得的所述包涵体沉淀依次进行洗涤处理和蛋白变性处理，获得shTNFR2变性蛋白液；步骤5)：将步骤4)获得的所述shTNFR2蛋白变性液进行稀释复性处理获得复性蛋白液；步骤6)：对步骤5)获得的所述复性蛋白液进行纯化处理获得所述shTNFR2蛋白；其中，所述步骤1)中，采用PCR扩增shTNFR2基因片段；所使用的PCR上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；所述步骤4)中，所述包涵体沉淀依次进行洗涤处理和蛋白变性处理后，再加入DTT至终浓度20～30mM，充分搅拌40
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60min，之后再加入氧化型谷胱甘肽至终浓度30～40mM，充分搅拌40
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60min，离心收集上清液，获得所述的shTNFR2变性蛋白液；所述步骤5)中，所述稀释复性处理所使用的复性缓冲液的pH值为10.0～10.5，盐浓度为20～50mmol/L，稀释比例为1:50～1:100。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述蛋白变性处理所使用的变性缓冲液的pH值为8～8.5，其含有50～100mmol/L Tris
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HCl、6mol/L Gua
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HCl、5
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10mmol/L EDTA和1～2mmol/L PMSF。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述复性缓冲液含有20～50mmol/L Tris
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HCl、20～50mmol/L NaCl、0.5～1mmol/L GSH、1～2mmol/L PMSF和1～2mmol/L EDTA。4.如权利要求1至3中任意一项所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，对所述包涵体沉淀的洗涤处理的过程为：采用第一洗涤...
【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书一零页序列表一页附图四页，
申请(专利权)人：上海市第十人民医院，
类型：发明
国别省市：
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