人多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于细胞领域，尤其涉及一种人多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法和应用。本发明专利技术中间充质干细胞的制备方法，包括：将人多能干细胞采用脑类器官1阶段培养基进行悬浮培养；在不同时期依次将培养基更换为不同阶段的脑类器官培养基；将细胞转入微型类器官生物反应器中，培养3

【技术实现步骤摘要】
人多能干细胞来源的间充质干细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于细胞领域，尤其涉及一种人多能干细胞脑类器官来源的间充质干细胞及其制备方法和神经修复领域的应用。
技术背景
[0002]类器官(Organoids)是一种在体外环境下由人多能干细胞或成体干细胞诱导分化，培育而成的具备三维结构的微器官，拥有大部分真实器官的细胞类型。类器官可自主排列形成组织、器官复杂结构，并能部分模拟来源组织或器官的发育过程和生理功能。借助类器官，研究人员可深入观察人体器官的发育过程和病理生理变化，更好地理解发育过程，并可用于再生医学以及药物的疗效筛选。由于类器官分化的细胞接近自然发育状态，从类器官能分离培养人胚胎发育过程中可能的具有治疗价值的细胞，并不受到伦理、来源不稳定的影响。因此，类器官研究具有广阔的发展前景。在特定的培养条件下，能从人多能干细胞培养形成人脑的类器官，人脑类器官具有人大脑皮层的5层结构，有成熟的神经元、胶质细胞、神经干细胞等人脑主要功能性细胞，并能检测到脑类器官类似于人脑脑电波的神经活动。
[0003]间充质干细胞是干细胞的一个研究分支，间充质干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新，具有免疫调节和组织修复能力，广泛的应用于临床研究中。通常的间充质干细胞的来源主要是人脐带、骨髓、脂肪、牙髓。但是这些来源的间充质干细胞具有异质性，作为药物研发可能在大规模生产的批次间存在较大的差异，从而影响细胞治疗效果。
[0004]人多能干细胞来源的类器官能在体外进行大量的制备，并且分化发育过程接近自然人体，是获取治疗用细胞的较好途径，然而如何有效的从脑类器官里提取各种具有治疗价值细胞还是本领域技术人员亟需攻克的难题。

技术实现思路

[0005]专利技术人从端脑类器官提取神经细胞的过程中，发现端脑类器官里存在一群间充质干细胞，通过优化各种培养条件，成功的制备得到该间充质干细胞(N
‑
MSCs)。
[0006]具体的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术第一个方面公开了一种间充质干细胞的制备方法，包括：
[0008]S1：培养人多能干细胞(人胚胎干细胞H1，诱导性多能干细胞iPS)；
[0009]S2：将S1得到的人多能干细胞(hPSCs)进行消化，记为D0，采用脑类器官1阶段培养基进行悬浮培养；
[0010]S3：在D4
‑
D6、D7
‑
D14、D15
‑
D21依次将培养基更换为脑类器官2阶段培养基、脑类器官3阶段培养基和脑类器官4阶段培养基；
[0011]S4：将细胞转入微型类器官生物反应器中，再培养3
‑
4天后接种到明胶包被的培养容器中，采用N
‑
MSCs第一阶段培养基进行贴壁培养得到间充质干细胞。
[0012]在本专利技术的一些具体实施例中，在S1中，hPSCs按照常规培养，培养于35mm的培养皿，每天换液，换液时间逐渐提前，培养基从开始的2ml逐渐增加到3ml。培养到密度90％时，将得到的人多能干细胞进行消化，记为day 0。
[0013]在本专利技术的一些具体实施例中，hPSCs无酶消化液为0.5mMEDTA
‑
DPBS。
[0014]优选的，在S2中，所述脑类器官1阶段培养基中加入了Y
‑
27632。
[0015]更优选的，所述Y
‑
27632的浓度为8
‑
12μM，所述微型类器官生物反应器的转速为60RPM。
[0016]优选的，所述脑类器官1阶段培养基包括：
[0017]GMEM基础培养基、NEAA(非必需氨基酸)1％
‑
2％、Glumax(谷氨酰胺)1％
‑
2％、Mercaptoethanol(氢硫酸乙醇)80
‑
120nM、KOSR(血清替代物)12
‑
18％、Dorsomorphin(二氢脱氧吗啡)0.8
‑
1.5μM、A83
‑
01(ALK
‑
4,5,7抑制剂)0.8
‑
1.2μM和聚乙烯醇0.5
‑
1.5％。
[0018]Dorsomorphin和A83
‑
01均为小分子化合物。
[0019]优选的，所述脑类器官2阶段培养基包括：GMEM基础培养基、NEAA1％
‑
2％、Glumax 1％
‑
2％、Mercaptoethanol 80
‑
120nM、N2 1％
‑
2％、SB
‑
431542(小分子抑制剂)0.8
‑
1.2μM、CHIR
‑
99021 0.8
‑
1.2μM、聚乙烯醇0.8
‑
1.5％。
[0020]SB 431542是一种强效的小分子抑制剂，选择性抑制转化生长因子β(TGF
‑
β)I型受体活化素受体样激酶ALK5(IC50＝94nM)，ALK4(IC50＝140nM)和ALK7。对其它与BMP蛋白结合的ALK家族分支成员如ALK2，ALK3或ALK6无任何抑制活性。SB 431542抑制TGF
‑
β诱导的骨肉瘤细胞的增殖，并促进胚胎干细胞(ESC)来源的内皮细胞的增殖、分化和片层形成。通过特异性阻断ALK/Smad信号通路，SB 431542不仅能够维持人胚胎干细胞的自我更新和胚状体的形成，还能够维持多潜能干细胞。SB 431542在体外诱导DC细胞成熟，同时在体内显示抗肿瘤的活性。与TGFβ活性相关的免疫耐受性患者使用SB 431542可能激活抗肿瘤的免疫应答。
[0021]CHIR
‑
99021(CT99021)是一种有效的选择性GSK
‑
3α/β抑制剂，IC50为10nM和6.7nM。CHIR
‑
99021对GSK
‑
3的选择性比CDC2，ERK2和其他蛋白激酶高500倍以上。CHIR
‑
99021还是一种有效的Wnt/β
‑
catenin信号通路激活剂。CHIR
‑
99021可增强小鼠和人类胚胎干细胞的自我更新。CHIR
‑
99021能诱导细胞自噬(autophagy)。
[0022]优选的，所述脑类器官3阶段培养基包括：MEM基础培养基、NEAA1％
‑
2％、Glumax 1％
‑
2％、Mercaptoethanol 80
‑
120nM、N2 1％
‑
2％、SB
‑
431542 0.8
‑
1.2μM、CHIR
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括：S1：培养人多能干细胞；S2：将S1得到的人多能干细胞进行消化，记为D0，采用脑类器官1阶段培养基进行悬浮培养；S3：在D4
‑
D6、D7
‑
D14、D15
‑
D21依次将培养基更换为脑类器官2阶段培养基、脑类器官3阶段培养基和脑类器官4阶段培养基；S4：将细胞转入微型类器官生物反应器中，培养3
‑
4天后接种到明胶包被的培养容器中，采用N
‑
MSCs第一阶段培养基进行贴壁培养得到间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Y
‑
27632的浓度为8
‑
12μM，所述微型类器官生物反应器的转速为60RPM。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脑类器官1阶段培养基包括：GMEM基础培养基、NEAA 1％
‑
2％、Glumax1％
‑
2％、Mercaptoethanol80
‑
120nM、KOSR12
‑
18％、Dorsomorphin0.8
‑
1.5μM、A83
‑
010.8
‑
1.2μM和聚乙烯醇0.5
‑
1.5％。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脑类器官2阶段培养基包括：GMEM基础培养基、NEAA 1％
‑
2％、Glumax 1％
‑
2％、Mercaptoethanol 80
‑
120nM、N2 1％
‑
2％、SB
‑
431542 0.8
‑
1.2μM、CHIR
‑
99021 0.8
‑
1.2μM、聚乙烯醇0.8
‑
1.5％。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：马峰，张勇刚，赖默温，
申请(专利权)人：成都云测医学生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：