一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分离方法技术

本发明专利技术公开了一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分离方法，涉及外泌体富集和分离技术领域以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：100

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分离方法


[0001]本专利技术涉及外泌体富集和分离
，具体而言，涉及一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分离方法。

技术介绍

[0002]外泌体(exosome)是一类可由多种细胞分泌并包裹了蛋白质、mRNA、微小RNA(microRNA)、非编码RNA(lncRNA)、DNA、脂质等物质的膜性囊泡,研究发现外泌体在细胞间通讯、肿瘤免疫、肿瘤治疗、组织损伤修复、疾病诊断中具有重要的意义。美国科学家James E.Rothman和Randy W.Schekman，德国科学家Thomas C.S
ü
dhof基于细胞内部囊泡(外泌体等)运输调控机制的发现共享了2013年诺贝尔生理或医学奖。
[0003]而间充质干细胞(MSCs)是一种来自于中胚层的多能干细胞,具有高度的自我更新及多向分化潜能,并在适宜的条件下具有诱导分化为肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、成脂细胞等多种细胞的能力。MSCs不仅具有多向分化潜能,而且还具有免疫调节功能,可抑制多种免疫细胞的性能,调节免疫应答。
[0004]近年来,研究发现,来源于MSCs的外泌体(MSCs
‑
Exo)具有与MSCs相似的组织损伤修复和再生功能。外泌体(exosome)是多种细胞分泌的膜外小囊泡,直径30～200nm,可以转运核酸、脂质和蛋白质,参与细胞间的信息交流。与MSCs相比,外泌体用于临床疾病的治疗更加稳定,体内同种异体给药后免疫排斥反应的可能性较低,并可为各种疾病提供替代疗法。MSCs
‑
Exo逐渐成为新的研究热点，特别是在MSCs
‑
Exo发挥组织损伤修复和再生功能的研究领域，MSCs
‑
Exo起到抗衰老和保健作用，同时也具有良好的美容作用。
[0005]目前，市售的脐带间充质干细胞培养基正常培养的脐带间充质干细胞其分泌的外泌体数量非常的少，培养的细胞数和分泌的外泌体数的比大约为1：5。也就是说，目前培养的脐带间充质干细胞只分泌很少量的外泌体，若要提炼出外泌体用于临床，必须培养大量干细胞，这样会产生巨大成本而失去实际应用意义。况且外泌体数量太少也给下游分离纯化带来较大的操作难度。此外，目前正常培养的脐带间充质干细胞的外泌体中含有的活性成分只是细胞间维持相互关系的成分例如主要含有G蛋白(调节细胞生化功能)，而激活修复组织细胞的成分含量较少，例如成纤维细胞生长因子(FGF)。
[0006]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分离方法以解决上述技术问题。
[0008]本专利技术是这样实现的：
[0009]本专利技术提供了一种外泌体分泌培养基，其以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：100
‑
300ng/ml的EGF、50
‑
150ng/ml的TGF、10
‑
30μg/ml的辅酶Q10、300
‑
600μ
g/ml的钾盐、0.3
‑
0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和100
‑
300μg/ml的组胺二盐酸盐。
[0010]在本专利技术应用较佳的实施方式中，以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200
‑
300ng/ml的EGF、100
‑
150ng/ml的TGF、20
‑
30μg/ml的辅酶Q10、300
‑
600μg/ml的钾盐、0.6
‑
0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和200
‑
300μg/ml的组胺二盐酸盐。
[0011]钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.008
‑
0.015mol/L，pH为7.4，氯化钾在混合盐溶液中的浓度为0.8
‑
1.2g/L。
[0012]在本专利技术应用较佳的实施方式中，以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200ng/ml的EGF、150ng/ml的TGF、30μg/ml的辅酶Q10、600μg/ml的钾盐、0.6μg/ml的果糖二磷酸钠和300μg/ml的组胺二盐酸盐；
[0013]优选地，钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.01mol/L，pH为7.4，氯化钾在混合盐溶液中的浓度为1g/L。组胺二盐酸盐是一种化学物质，分子式：C5H9N3·
2HCl。
[0014]在本专利技术应用较佳的实施方式中，无血清干细胞培养基以D
‑
MEM培养基和人血白蛋白为基础培养基。D
‑
MEM培养基是美国GIBCO公司产品，人血白蛋白是临床使用药品，配制好的干细胞培养基含质量浓度为5％
‑
10％人血白蛋白。
[0015]本专利技术还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的培养方法，其包括如下步骤：将脐带间充质干细胞传代培养至第三代后，去除培养基，清洗细胞后加入上述的外泌体分泌培养基进行培养。
[0016]在本专利技术应用较佳的实施方式中，加入外泌体分泌培养基后每间隔1
‑
3天更换一次外泌体分泌培养基，并收集每次更换后的培养液。
[0017]在本专利技术应用较佳的实施方式中，更换培养基前，对脐带间充质干细胞总细胞数进行计数，按照每100万个加入10
‑
20ml分泌外泌体培养基。
[0018]本专利技术还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的分离方法，其包括如下步骤：
[0019]收集由脐带间充质干细胞外泌体的培养方法培养后的培养液，并进行脱细胞处理获得脐带间充质干细胞外泌体。
[0020]在本专利技术应用较佳的实施方式中，脱细胞处理为离心处理。
[0021]在本专利技术应用较佳的实施方式中，离心的速度为1000
‑
1500rpm，时间为10
‑
15分钟。
[0022]本专利技术具有以下有益效果：
[0023]本专利技术提供了一种新的外泌体分泌培养基，借助该分泌培养基可以使得脐带间充质干细胞大量分泌外泌体，细胞数和分泌的外泌体数的比大约为1：50至1:80。也即，采用本专利技术提供的外泌体分泌培养基可以在相同数量的培养细胞条件下获得更多数量的外泌体。上述外泌体分泌培养基有利于大规模生产具有良好生物活性的脐带间充质干细胞外泌体，进而推动外泌体在医疗、抗衰老、美容等广泛应用，具有良好的经济效益。
[0024]本专利技术提供的外泌体分泌培养基的成分侧重于激活干细胞的修复功能，其分泌外泌体含有的EGF、TGF、辅酶Q10可以刺激脐带间充质干细胞向上皮细胞方向分化，并初步使得分化后的脐带间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体分泌培养基，其特征在于，其以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：100
‑
300ng/ml的EGF、50
‑
150ng/ml的TGF、10
‑
30μg/ml的辅酶Q10、300
‑
600μg/ml的钾盐、0.3
‑
0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和100
‑
300μg/ml的组胺二盐酸盐。2.根据权利要求1所述的外泌体分泌培养基，其特征在于，以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200
‑
300ng/ml的EGF、100
‑
150ng/ml的TGF、20
‑
30μg/ml的辅酶Q10、300
‑
600μg/ml的钾盐、0.6
‑
0.9μg/ml的果糖二磷酸钠和200
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300μg/ml的组胺二盐酸盐；所述钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的混合盐溶液，所述磷酸二氢钾缓冲液和磷酸氢二钾缓冲液的总浓度为0.008
‑
0.015mol/L，pH为7.4，所述氯化钾在混合盐溶液中的浓度为0.8
‑
1.2g/L。3.根据权利要求1或2所述的外泌体分泌培养基，其特征在于，以无血清干细胞培养基为基础培养基，添加以下组分：200ng/ml的EGF、150ng/ml的TGF、30μg/ml的辅酶Q10、600μg/ml的钾盐、0.6μg/ml的果糖二磷酸钠和300μg/ml的组胺二盐酸盐；优选地，所述钾盐为：氯化钾溶于磷酸二氢钾缓冲液和磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：麦志国，刘元旦，陈群珍，尹丽珍，
申请(专利权)人：广州研华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：