一种促进干细胞细胞因子产量的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种促进干细胞细胞因子产量的生产方法，该方法使用了能够特异性针对PTN的单克隆抗体，所述抗体能够有效的诱导骨髓间充质干细胞成脂分化，并且在分化后能够高效的促进SCF和VEGF细胞因子高分泌，通过分离纯化含有所述高产量的细胞因子可以用于后续的研究。究。

【技术实现步骤摘要】
一种促进干细胞细胞因子产量的生产方法


[0001]本申请涉及生物领域，更具体的，涉及一种一种促进干细胞细胞因子产量的 生产方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(MSCs)是干细胞家族的重要成员，不仅存在于骨髓、脂肪、脐 血和外周血中，还存在于软骨膜、骨膜、肌肉及骨小梁中。目前研究较多的是骨 髓间充质干细胞(BMSCs)。其基本特性有：自我更新能力，在体内可增殖形成组 织并维持自身的数量，在体外可克隆生长。增殖分化能力，在一定环境和特定因 子的诱导下，可以分化为肌肉、神经、软骨、骨、脂肪、肌腱及韧带等组织。由 于BMSCs具有可多向分化、体外扩增能力强、来源广泛、取材方便、对机体损伤 小等优点，已成为骨组织工程研究目前最常用的种子细胞。其在体外分化需要适 宜的培养条件或诱导剂，相关生长因子可以促进其增殖与分化，并依赖于细胞因 子的调节。
[0003]骨质疏松症是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征，致使骨的脆性增加以 致易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。骨组织中成骨细胞和破骨细胞的功能失 衡是导致骨质疏松症的主要病因。现已证实，骨髓腔内的脂肪细胞增加与骨形成 能力下降存在密切的联系。而且骨髓腔内的脂肪细胞和成骨细胞均来源于骨髓间 充质干细胞，两者具有相同的细胞表型，在一定条件下可以互相转换，并且存在 此消彼长的关系。而骨质疏松症可能是骨髓间充质干细胞分化失衡后过多地向脂 肪细胞分化所致。因此，通过抑制骨髓间充质干细胞向成脂方向分化来防治骨质 疏松症很值得我们研究。现阶段骨质疏松症治疗药物主要是针对破骨细胞和成骨 细胞而研制，虽然对骨质疏松症有一定疗效，但存在不良反应大及患者不能长期 耐受等缺点。迄今为止，还没有一种安全有效的药物帮助已疏松的骨骼恢复原状。 因此，研究骨髓间充质干细胞在转化为成脂过程中的某些重要影响因素，可为骨 质疏松症的发病机制研究及药物筛选提供一定基础。长期研究发现，雌激素、维 生素D3、PPARS等细胞核激素受体可影响骨髓间充质干细胞向成脂方向分化。因 此，研究骨髓间充质干细胞的成脂分化时目前重要的研究方向。
[0004]此外，骨髓间充质干细胞能够合成并分泌多种细胞因子，如表皮生长因子、 碱性成纤维细胞生长因子、血小板生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子、 肝细胞生长因子、白介素6等。这些因子在干细胞成脂分化过程中的表达各不相 同。此前研究表明，黄芪甲甙与MSCs共培养后，MSCs的增殖指数明显增加，黄芪 甲甙促进MSCs增殖呈时间依赖性，但当达到一定的药物浓度后，增殖指数将不再 增加。通过检测SCF、TPO、GM—CSF、TGF的表达发现，加入黄芪甲甙后SCF的表 达较对照组明显增高，其他细胞因子的表达差异无统计学意义，亦未见IL
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3mRNA 的表达，因此，黄芪甲甙可以诱导和促进MSCs分泌SCF。该方法，可以用于特定 的SCF的生产和富集，用于后续的治疗用途。
[0005]然而在现有技术中，还没有验证促进骨髓间充质干细胞快速增殖后成脂分 化，检测相应细胞因子的变化情况，更没有涉及相应的细胞因子的生产和富集的 研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对现有技术的缺陷，提供了一种改进的促进细胞因子分泌的方法， 特别是高表达的SCF和VEGF细胞因子。
[0007]本专利技术一方面，提供一种特异性针对PTN的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻 链可变区的序列为(SEQ ID NO：1)，重链可变区的序列为(SEQ ID NO：2)。
[0008]本专利技术更进一步的，提供所述改进的针对PTN的单克隆抗体，所述改进为保守 修饰或者保守修饰的变体。
[0009]本申请中的“保守修饰”是指基本不影响原序列抗体特性的氨基酸修饰，包括 氨基酸的突变、插入和缺失，具体修饰方式可以是本领域已知的修饰手段，如定 点突变或PCR介导的诱变等。氨基酸的保守取代是指其氨基酸残基被具有相似侧 链的氨基酸残基取代。氨基酸残基家族为本领域公知定义，包括具有碱性侧链的 氨基酸(如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链氨基酸(如天冬氨酸，谷氨酸)， 不带电荷的极性侧链氨基酸(如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸， 酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，非极性侧链氨基酸(如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸， 异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸)，β支链侧链氨基酸(如苏氨酸，缬氨酸， 异亮氨酸)和芳香族侧链(如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，CDR 区的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基代替，并 进行检测确保其保留原序列的功能。
[0010]本申请中的“保守修饰的变体”包括多肽序列的个别氨基酸被功能相似氨基 酸取代、缺失或添加，还包括多态性变体、种间同系物及其等位基因。以下各组 内氨基酸可以相互取代：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)； 3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮 氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7) 丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)。本申请中“保守序列修饰
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指基本上不影响或改变其结合能力的氨基酸修饰。
[0011]本专利技术另外一方面，提供一种诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的方法，人骨 髓间充质干细胞采用10％胎牛血清的DMEM培养基培养达80％融合，开始加入含有 单抗的分化诱导液其组成为内含0.5mmol/L 3
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异丁基
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甲基黄嘌呤、10mg/L胰 岛素、0.2mmol/L吲哚美辛、1μmol/L地塞米松及10μmol/L的单克隆抗体和10％ 胎牛血清的DMEM培养基。每3d更换一次分化诱导液，持续诱导10d后收获所述细 胞即为诱导后的分化细胞。
[0012]本专利技术另外提供一种高表达SCF和VEGF细胞因子的制备方法，所述方法为将 前述诱导后的细胞接种于培养容器中进行培养；将过夜后的细胞用0.25％胰酶
ꢀ‑
EDTA溶液消化，然后离心，用0.9％生理盐水调整细胞浓度至1
×
108个细胞/mL， 然后将细胞裂解，然后细胞裂解液转移至50mL离心管中，于20℃，5000r/min条 件下离心10min，然后用0.22μm过滤器过滤裂解液上清，最后加入0.9％生理盐 水、3mg/mL的EDTA，制得含有SCF和VEGF高含量的细胞因子。
[0013]有益效果
[0014]本专利技术通过筛选，获得了能够特异性针对PTN的单克隆抗体，所述抗体能够 有效的诱导骨髓间充质干细胞成脂分化，并且在分化后能够高效的促进SCF和 VEGF细胞因子高分泌，通过分离纯化含有所述高产量的细胞因子可以用于后续的 研究。
附图说明
[0015]图1成脂分化后的OD值结果图
[0016]图2成脂分化后基因变化结果图
[0017]图3成脂诱导分化后的细胞内细胞因子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高表达SCF和VEGF细胞因子的分化细胞的制备方法，其特征在于：人骨髓间充质干细胞采用10％胎牛血清的DMEM培养基培养达80％融合，开始加入含有5H2单克隆抗体的分化诱导液其组成为内含0.5mmol/L 3
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异丁基
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甲基黄嘌呤、10mg/L胰岛素、0.2mmol/L吲哚美辛、1μmol/L地塞米松及10μmol/L的单克隆抗体和10％胎牛血清的DMEM培养基；每3d更换一次分化诱导液，持续诱导10d后收获所述细胞即为诱导后的分化细胞；其中，所述5H2单克隆抗体的轻链可变区的序列为SEQ ID NO：1，重链可变区的序列为SEQ ID NO：2。2.一种高表达SCF和VEGF细胞因子的制备方法，其特征在于将权利要求1所述制备方法制备得到的分化细胞接种于培养容器中进行培养；将过夜后的细胞用0.25％胰酶
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EDTA溶液消化，然后离心，用0.9％生理盐水调整细胞浓度至1
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108个细胞/mL，然后将细胞裂解，然后细胞裂解液转移至50mL离心管中，于20℃，500...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海涛，李娜，
申请(专利权)人：北京欣颂生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：