一种检测疫苗中蛋白A等杂质的试纸条及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测疫苗中蛋白A等杂质的试纸条及其应用。试纸条包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，所述反应膜上具有包被有蛋白A和庆大霉素半抗原

【技术实现步骤摘要】
一种检测疫苗中蛋白A等杂质的试纸条及其应用


[0001]本专利技术涉及一种检测疫苗中蛋白A等杂质的试纸条及其应用，具体涉及一种检测疫苗中蛋白A等杂质的胶体金试纸条，其特别适用于疫苗中蛋白A、庆大霉素等杂质的残留量。

技术介绍

[0002]WHO、ICH的相关法规及中国药典2010年版三部均对杂质的去除及残留限度有描述和规定。蛋白A(Protein A，ProA)是最早发现的与免疫球蛋白结合的分子之一，其作为亲和色谱的重要介质，广泛应用于Fc融合蛋白和单克隆抗体的纯化工艺过程中，ProA亲和色谱法用于纯化，优点是高性能和高纯度，缺点是能浸出ProA，属于下游工艺源杂质。浸出的ProA一方面作为金黄色葡萄球菌的膜蛋白具有免疫原性，有促有丝分裂的作用，所以控制其残留水平是保证药物安全性的一项重要指标，另外，残留ProA检测在工艺过程中也是监测色谱柱完整性的工具。残留ProA检测中，因ProA具有能够结合IgG分子的特点，从而阻碍其与相应抗体的结合，常常造成检测结果的不准确，所以该项目不但是重组Fc融合蛋白和单克隆抗体质量控制的重要指标，也一直是质量控制的难点。另外，庆大霉素等抗生素也可能存在于疫苗中，是需要检测的杂质。
[0003]通过免疫化学检测法对药物进行检测，具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量监测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。本申请研究出蛋白A和庆大霉素的抗体制备方法，并将其应用于快速检测试纸条中，用时短，操作简单，成本较低，适用于基层单位大批量地检测样品。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的蛋白A和庆大霉素残留检测试纸条。
[0005]本专利技术所提供的检测蛋白A和庆大霉素残留的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)；所述反应膜上具有包被有蛋白A和庆大霉素半抗原
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载体蛋白偶联物的检测线(5)以及包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有蛋白A单克隆抗体
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胶体金标记物和庆大霉素单克隆抗体
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胶体金标记物。
[0006]所述庆大霉素半抗原
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载体蛋白偶联物是由庆大霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。
[0007]所述蛋白A和庆大霉素单克隆抗体是分别以蛋白A和庆大霉素半抗原
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载体蛋白偶联物作为免疫原制备，再分别由蛋白A单克隆抗体杂交瘤细胞株、庆大霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。
[0008]所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。
[0009]所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
[0010]本专利技术的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：
[0011]1)制备喷涂有蛋白A单克隆抗体
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胶体金标记物和庆大霉素单克隆抗体
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胶体金标记物的结合物释放垫；
[0012]2)制备具有包被有蛋白A和庆大霉素半抗原
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载体蛋白偶联物的检测线，以及包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
[0013]3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
[0014]具体地说，步骤包括：
[0015]1)庆大霉素半抗原制备：将庆大霉素与4,4ˊ
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二氟
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3,3ˊ
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二硝基二苯砜等物质经过一系列化学反应得到庆大霉素半抗原；
[0016]2)将庆大霉素半抗原与载体蛋白偶联，得到庆大霉素半抗原
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载体蛋白偶联物；
[0017]3)分别用蛋白A和庆大霉素半抗原
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载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到蛋白A单克隆杂交瘤细胞株和庆大霉素单克隆杂交瘤细胞株；
[0018]4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
[0019]5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
[0020]6)将步骤3)制备的蛋白A和庆大霉素单克隆抗体分别加入步骤5)制备的胶体金中，分别得到蛋白A单克隆抗体
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胶体金标记物和庆大霉素单克隆抗体
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胶体金标记物；
[0021]7)分别将蛋白A单克隆抗体
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胶体金标记物和庆大霉素单克隆抗体
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胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；
[0022]8)分别将蛋白A半抗原
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载体蛋白偶联物和庆大霉素半抗原
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载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；
[0023]9)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；
[0024]10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下可保存12个月。
[0025]本专利技术的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测疫苗中蛋白A和庆大霉素残留的方法，它包括步骤：
[0026](1)样品前处理；
[0027](2)用试纸条进行检测；
[0028](3)分析检测结果。
[0029]本专利技术的蛋白A和庆大霉素快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及竞争抑制免疫层析分析技术，将蛋白A单克隆抗体
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胶体金标记物和庆大霉素单克隆抗体
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胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的蛋白A和庆大霉素在流动过程中，分别与结合物释放垫上的蛋白A单克隆抗体
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胶体金标记物和庆大霉素单克隆抗体
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胶体金标记物结
合，形成药物
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抗体
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胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的蛋白A和庆大霉素半抗原
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载体蛋白偶联物竞争结合蛋白A单克隆抗体
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胶体金标记物和庆大霉素单克隆抗体
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胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有蛋白A和庆大霉素残留。
[0030]检测时，样品经处理后滴入试纸条孔内，当蛋白A和庆大霉素在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体
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胶体金本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测疫苗中蛋白A等杂质的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，其特征在于所述反应膜上具有包被有蛋白A和庆大霉素半抗原
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载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有蛋白A单克隆抗体
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胶体金标记物和庆大霉素单克隆抗体
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胶体金标记物，所述庆大霉素半抗原的制备方法如下：取庆大霉素1.39g，加纯水80ml溶解，取4,4ˊ
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二氟
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3,3ˊ
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二硝基二苯砜0.344g加30ml甲醇溶解，加入到庆大霉素的水溶液中，加无水碳酸钾1.38g，室温搅拌3h，停止反应，加乙酸乙酯300ml萃取，静置，分去水相，有机相浓缩蒸干，无水乙醇20ml重结晶，得到氟硝基苯
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庆大霉素半抗原产物0.34g，收率43.9％。2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上。3.如权利要求1
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2任一项所述的试纸条，...

【专利技术属性】
技术研发人员：万宇平，吴小胜，张瑜，王兆芹，赵正苗，凡静静，何方洋，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：