一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III的方法及其所制备的SUMO_肝素酶III融合蛋白技术方案

本发明专利技术公开了利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III的方法及其所制备的肝素酶III，该制备方法包括下列步骤：选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶III序列，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，共659aa；去除信号肽序列，获得肝素酶III的DNA序列，如SEQIDNo.2；将所述肝素酶III的DNA序列插入带有N端SUMO蛋白标签的pSMART载体质粒；将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，通过发酵和纯化获得融合蛋白；用SUMO蛋白酶将SUMO标签蛋白从融合蛋白上切割下来，即获得肝素酶III。本发明专利技术的优点是：提高目标蛋白质的可溶性、促进目标蛋白质的正确折叠，避免形成包涵体；降低纯化成本、提高纯化效率；SUMO蛋白标签分子量较小，对肝素酶III的酶活性影响较小，获得纯化的肝素酶III。获得纯化的肝素酶III。获得纯化的肝素酶III。

【技术实现步骤摘要】
一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III的方法及其所制备的SUMO_肝素酶III融合蛋白
[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及涉及一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III(heparinase III)的方法。

技术介绍

[0002]肝素酶主要从一些利用肝素为碳源的细菌中分离得到，最初来源于肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)，从肝素黄杆菌中分离纯化出的肝素酶有三种，分别为肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶的主要作用是降解肝素，在酶降解法生产低分子肝素和超低分子肝素中有广泛应用。
[0003]目前用于低分子肝素生产的肝素酶产品主要有两种来源：一是直接从产肝素酶的微生物中发酵提取(深圳市海普瑞药业股份有限公司， CN102286448B)；二是通过基因工程技术构建重组肝素酶工程菌，发酵提取重组肝素酶。
[0004]直接从产肝素酶的微生物(如肝素黄杆菌等)中提取肝素酶III，发酵条件和纯化工艺相对复杂，通过菌种选育提高产量的潜力有限。
[0005]基因工程重组技术已广泛应用于蛋白质制备，目前已有将麦芽糖结合蛋白(MBP)标签与肝素酶III形成融合蛋白等应用。采用基因工程重组技术在大肠杆菌系统中生产肝素酶III等外源蛋白质时面临两个挑战：一是所用蛋白质表达系统的表达水平较低；二是所表达的蛋白质被错误折叠进不溶性的聚集体——包涵体中，提取和复性困难。
[0006]目前，采用可溶性蛋白标签与肝素酶III形成融合蛋白，可以显著提高重组产物的溶解性。但是，类似谷胱甘肽巯基转移酶标签(GST
‑
Tag)、麦芽糖结合蛋白标签(MBP
‑
Tag)、转录抗终止因子A标签(NusA
‑
Tag)等融合蛋白标签，因为分子量较大(26
‑
55kDa)，会干扰目标蛋白质的正常功能，并且在表达和后续纯化过程中去除标签等环节相对降低了目标蛋白质的产率。

技术实现思路

[0007]为解决现有技术的缺陷和不足，本专利技术的目的是提供一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III(heparinase III)的方法，以极大地提高目标蛋白质的稳定性和可溶性，提高目标蛋白质的活性及产率。
[0008]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0009]根据本专利技术的一个方面，提供了一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III(heparinase III)的方法，包括下列步骤：
[0010]S01：选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶III序列，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，共659aa；
[0011]S02：去除信号肽序列，获得肝素酶III的DNA序列，如SEQIDNo.2；
[0012]S03：将所述肝素酶III的DNA序列插入带有N端SUMO蛋白标签的 pSMART载体质粒；
[0013]S04：将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，经发酵
和纯化获得SUMO_肝素酶III融合蛋白；
[0014]S05：用SUMO蛋白酶将SUMO标签蛋白从步骤S04所述的SUMO_肝素酶 III融合蛋白上切割下来，即获得肝素酶III。
[0015]进一步地，还包括融合蛋白表达条件的优化步骤。
[0016]进一步地，所述融合蛋白的优化条件是融合蛋白在15℃以0.2mmol/l 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。
[0017]进一步地，还包括融合蛋白的纯化步骤。
[0018]进一步地，所述融合蛋白的纯化步骤采用Ni柱亲和层析方法进行分离纯化。
[0019]进一步地，所述的SUMO标签蛋白从步骤S04所述的SUMO_肝素酶III 融合蛋白上切割下来是包括下列步骤：将所述融合蛋白透析更换缓冲液，加入适量的SUMO蛋白酶，混匀后置于4℃反应过夜，水解后的融合蛋白样本用Ni柱亲和层析方法将带有6个组氨酸片段的SUMO蛋白标签(能结合到Ni柱上)与肝素酶III(不能结合到Ni柱上)分离。
[0020]根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种按照上述方法制备的SUMO_ 肝素酶III融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3。
[0021]根据本专利技术的再一个方面，还提供了一种按照上述方法制备的肝素酶 III。
[0022]通过本专利技术的技术方案，利用SUMO融合表达系统制备的重组肝素酶 III，融合在目标蛋白质N端的较小的类泛素蛋白修饰物(smallubiquitin
‑
like modifier，SUMO)标签蛋白，分子量大约11kDa，能够极大地提高目标蛋白质的稳定性和可溶性，对目标蛋白质的活性影响较小。并且，SUMO蛋白酶(SUMO Protease)是一种具有较高活性的半胱氨酸蛋白酶，它能识别SUMO标签蛋白的三级结构，而不是氨基酸序列，因此可以高效而且特异性地将SUMO标签蛋白从重组融合蛋白上切割下来，从而获得肝素酶III。
[0023]采用SUMO蛋白标签融合表达系统制备重组肝素酶III的优点：
[0024]1)提高目标蛋白质的可溶性、促进目标蛋白质的正确折叠，避免形成包涵体；
[0025]2)SUMO蛋白标签近N端有6个组氨酸片段，使融合蛋白可以用Ni柱亲和层析方法一步纯化，降低纯化成本、提高纯化效率；
[0026]3)SUMO蛋白标签分子量较小，对肝素酶III的酶活性影响较小，即使不切除融合蛋白中的蛋白标签，也能得到较高活性的肝素酶III；
[0027]4)SUMO蛋白酶能识别SUMO标签蛋白的三级结构，可以高效而且特异性地将SUMO标签蛋白从重组融合蛋白上切割下来，从而获得纯化的肝素酶III。
[0028]下面结合附图，对本专利技术的具体实施方式作进一步的详细说明。对于所属
的技术人员而言，从对本专利技术的详细说明中，本专利技术的上述和其他的目的、特征和优点将显而易见。
附图说明
[0029]图1为本专利技术一实施例中肝素酶III表达鉴定的SDS
‑
PAGE电泳分析图；
[0030]图2为本专利技术一实施例中肝素酶III表达优化的SDS
‑
PAGE电泳分析图；
[0031]图3为本专利技术一实施例中肝素酶III可溶性分析的SDS
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PAGE电泳分析图；
[0032]图4为本专利技术一实施例中肝素酶III亲和纯化结果的SDS
‑
PAGE电泳分析图；
[0033]图5为本专利技术一实施例肝素酶III免疫印迹Western Blot的SDS
‑ꢀ
PAGE电泳分析
图；
[0034]图6为本专利技术一实施例中肝素酶III去除标签的SDS
‑
PAGE电泳分析图。
具体实施方式
[0035]下面通过具体实施方式及实施例并结合附图对本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III的方法，其特征在于，包括下列步骤：S01：选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶III序列，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，共659aa；S02：去除信号肽序列，获得肝素酶III的DNA序列，如SEQ ID No.2；S03：将所述肝素酶III的DNA序列插入带有N端SUMO蛋白标签的pSMART载体质粒；S04：将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，经发酵和纯化获得SUMO_肝素酶III融合蛋白；S05：用SUMO蛋白酶将SUMO标签蛋白从步骤S04所述的SUMO_肝素酶III融合蛋白上切割下来，即获得肝素酶III。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括融合蛋白表达条件的优化步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白的优化条件是融合蛋白在15℃以0.2mmol/l异丙基硫代半乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋建华，张亮，邢岭，吴双，高伟，
申请(专利权)人：上海宝维医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：