一种用于直接分化多能性干细胞来源间充质干细胞的培养基、用其制备间充质干细胞的方法以及由此制备的间充质干细胞技术

本发明专利技术涉及一种用于直接分化胚胎干细胞来源间充质干细胞的培养基、用其制备间充质干细胞的方法、由此制备的间充质干细胞以及包括其的细胞治疗剂，根据一方面的培养基组合物和方法，不仅可以在短时间内以高产率制备间充质干细胞，而且由于没有胚状体形状的步骤，因此制备工艺简单，并且可以获得具有均质性的细胞，从而具有可以在比现有方法更短的时间内提供细胞治疗剂的效果。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种用于直接分化多能性干细胞来源间充质干细胞的培养基、用其制备间充质干细胞的方法以及由此制备的间充质干细胞
本专利技术涉及一种直接分化多能性干细胞，例如胚胎干细胞来源间充质干细胞的培养基、用其制备间充质干细胞的方法、由此制备的间充质干细胞以及包括其的细胞治疗剂。
技术介绍
作为使用人胚胎干细胞制备间充质干细胞的现有技术，有一种在形成胚状体后处理TGF-β抑制剂14天的制备方法。TGF-β抑制剂的处理是为了通过抑制胚状体的内胚层系细胞分化来容易确保中胚层系细胞而实施的。另外，通常在用人胚胎干细胞制备间充质干细胞时使用的TGF-β抑制剂中，SB431542的处理量为10μM以上。在TGF-β抑制剂中，用1μM以上的SB431542处理具有抑制内胚层系分化所需的转录因子的活性并增加中胚层系分化所需的转录因子的活性的作用。另外，在不经过胚状体的直接分化方法中，也存在通过用TGF-β抑制剂之一的SB431542处理诱导分化的情况，但据报道，在大多数情况下，在10μM以上的高浓度下需要11天以上的药物处理期间。因此，根据现有报道的方法制备的间充质干细胞需要长时间才可以表现出高含量的中胚层特性。此外，即使形成大小和形状均一的胚状体以使用，由于构成胚状体的内部和外部的细胞中微环境的差异，所处理药物的效果也可能不均匀，因此可以存在会影响分化效率和分化细胞性质的技术不稳定性问题。据此，尽管其是基于细胞的增殖现象制备的生物学治疗剂，但其制备过程中并未采取任何预防或补充措施来防止可能由增殖现象引起的细胞衰老和突变的风险，因此需要解决该问题的技术方案。
技术实现思路
技术问题本专利技术一方面提供一种用于诱导多能性干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合物，其包括DNA修复剂(DNArepairagent)和ROCK(Rho-associated,coiled-coilcontainingproteinkinase)抑制剂。本专利技术另一方面提供一种DNA修复剂(DNArepairagent)和ROCK(Rho-associated,coiled-coilcontainingproteinkinase)抑制剂在制备用于诱导多能性干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合物中的用途。本专利技术另一方面还提供一种多能性干细胞来源间充质干细胞的制备方法，其包括：培养已分离的多能性干细胞；以及将所述培养的多能性干细胞在含有DNA修复剂(DNArepairagent)和ROCK(Rho-associated,coiled-coilcontainingproteinkinase)抑制剂的培养基中培养以诱导分化为间充质干细胞。本专利技术另一方面还提供一种在DNA修复剂(DNArepairagent)和ROCK(Rho-associated,coiled-coilcontainingproteinkinase)抑制剂的存在下诱导分化的多能性干细胞来源间充质干细胞。本专利技术另一方面还提供一种细胞治疗剂，其包括所述多能性干细胞来源间充质干细胞。本专利技术另一方面还提供一种所述多能性干细胞来源间充质干细胞在制备细胞治疗剂中的用途。本专利技术另一方面还提供一种疾病的治疗方法，所述方法包括：将所述多能性干细胞来源间充质干细胞施用于个体。技术方案本专利技术一方面提供一种用于诱导多能性干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合物，其包括DNA修复剂(DNArepairagent)和ROCK(Rho-associated,coiled-coilcontainingproteinkinase)抑制剂。本专利技术另一方面提供一种DNA修复剂(DNArepairagent)和ROCK(Rho-associated,coiled-coilcontainingproteinkinase)抑制剂在制备用于诱导多能性干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合物中的用途。在本说明书中，“多能性干细胞”是指可以自我更新(具有在保持未分化状态下通过多个细胞分裂周期的能力)并表现出一种以上的多分化能(分化为至少一种专门细胞的性能)的细胞。间充质干细胞(MSC，MesenchymalStemCell)为一种多分化能干细胞，其具有分化成各种中胚层细胞或如神经细胞的外胚层细胞的能力，所述中胚层细胞包括骨骼、软骨、脂肪和肌肉细胞。所述多能性干细胞为核移植人多能性干细胞(NT-hPSC)、孤雌生殖体来源多能性干细胞(pn-hPSC)、诱导多能性干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。在本专利技术中，“体细胞”是指除生殖细胞或其前体以外的体内任何组织细胞。本文所用的“成熟”是指由向最终分化的细胞类型引导的协调的生化步骤组成的过程。本文所用的“分化”是指细胞适应特定形式或功能。本文所用的“分化的细胞”包括以其原始形式不具有多能性的任何体细胞，如本文所定义。因此，术语“分化的细胞”还包括部分分化的细胞，例如多分化能细胞，或使用本文所述的任何组合物和方法产生的稳定的非多能性部分重编程或部分分化的细胞。在一些实施方案中，分化的细胞为稳定的中间细胞，例如非多能性、部分重编程的细胞。应注意，将许多原代细胞置于培养物中可导致完全分化特性受到一些损失。因而，简单地培养此类分化的或体细胞不会使得这些细胞变成非分化的细胞(例如，未分化细胞)或多能性细胞。分化的细胞(包括稳定的非多能性部分重编程的细胞中间体)向全能性的转变需要超过导致在置于培养物中时分化的特性部分丧失的刺激的重编程刺激。与亲本细胞相比，重编程的、在一些实施方案中部分重编程的细胞还具有经受延长的传代培养的能力而不丧失生长潜力的特性，所述亲本细胞通常具有较低的发育潜能，仅能在培养物中进行有限数量的分裂。在一些实施方案中，术语“分化的细胞”还指由特化程度较低的细胞类型(即，发育潜能增加)(例如，未分化细胞或重编程的细胞)的细胞(其中，细胞经受细胞内分化过程)衍生出的特化程度较高的细胞类型(即，发育潜能减少)的细胞。具体地，在本说明书中，其可以选自造血干细胞、肌肉细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞、上皮细胞、泌尿系统细胞、脂肪细胞、肾细胞、血管细胞、视网膜细胞、间充质干细胞(MSC)和神经元细胞。根据一具体实施例，所述DNA修复剂可以为增加RAD51活性的物质(RAD51激活剂)。所述Rad51激活剂可以为3-[(苄基氨基)磺酰基]-4-溴-N-(4-溴苯基)苯甲酰胺(3-[(benzylamino)sulfonyl]-4-bromo-N-(4-bromophenyl)benzamide)或4-溴-N-(4-溴苯基)-3-[[(苯基甲基)氨基]磺酰基]-苯甲酰胺(4-Bromo-N-(4-bromophenyl)-3-[[(phenylmethyl)amino]sulfonyl]-benzamide)。所述DNA修复剂可以以5μM至25μM、5μM至20μM、6μM至18μM、8μM至15μM或8μM至12μM的浓度包括。RAD51激活剂可以具有通过保持具修复受损DNA的功能的RAD51蛋白与ss本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于诱导多能性干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合物，其包括DNA修复剂和ROCK抑制剂。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180907 KR 10-2018-01073851.一种用于诱导多能性干细胞分化为间充质干细胞的培养基组合物，其包括DNA修复剂和ROCK抑制剂。


2.如权利要求1所述的培养基组合物，其中，所述DNA修复剂为3-[(苄基氨基)磺酰基]-4-溴-N-(4-溴苯基)苯甲酰胺或4-溴-N-(4-溴苯基)-3-[[(苯基甲基)氨基]磺酰基]-苯甲酰胺。


3.如权利要求1所述的方法，其中，所述ROCK抑制剂为选自法舒地尔、利帕舒地尔、4-((R)-1-氨乙基)-N-(吡啶-4-基)环己甲酰胺、4-(1-氨乙基)-N-(1H-吡咯并(2,3-b)吡啶-4-基)环己甲酰胺二盐酸盐、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-1,4,5,6-四氢-2-甲基-6-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3-吡啶甲酰胺，以及1-(3-羟基苄基)-3-[4-(吡啶-4-基)噻唑-2-基]脲、2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂卓二盐酸盐、N-[2-[2-(二甲氨基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基-2,3-二氢-1,4-苯并二噁烷-2-甲酰胺二盐酸盐、2-氟-N-[[4-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)苯基]甲基]苯甲胺二盐酸盐、N-[3-[[2-(4-氨基-1,2,5-恶二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧]苯基]-4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]苯甲酰胺、(3S)-1-[[2-(4-氨基-1,2,5-恶二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-7-基]羰基]-3-吡咯烷胺二盐酸盐、N-[(1S)-2-羟基-1-苯基乙基]-N'-[4-(4-吡啶基)苯基]-脲、氮杂吲哚-1，以及水仙环素中的任何一种。


4.如权利要求1所述的培养基组合物，其进一步包括TGF-β抑制剂。


5.如权利要求4所述的培养基组合物，所述TGF-β抑制剂为选自4-{4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-吡啶-2-yl}-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺水合物、4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉、2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶、4-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺水合物、4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物，以及4-[4-(3,4-亚甲二氧苯基)-5-(2-吡啶烷基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物、3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酯胺、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶、4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉、2-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-yl]-6-甲基-吡啶、2-(5-氯-2-氟苯基)-4-[(4-吡啶烷基)氨基]蝶啶、6-[2-叔丁基-5-(6-甲基-吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基]-喹喔啉、4-{4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-吡啶-2-yl}-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺水合物、4-[2-氟-5-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]苯基]-1H-吡唑-1-乙醇、3-[[5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-(6-喹噁啉基)-1H-咪唑-2-基]甲基]苯甲酰胺中的任何一种。


6.如权利要求1所述的培养基组合物，其中，以5μM至20μM的浓度包括所述DNA修复剂。


7.如权利要求1所述的培养基组合物，其中，以5μM至20μM的浓度包括所述ROCK抑制剂。


8.如权利要求4所述的培养基组合物，其中，以0.2μM至2.0μM的低浓度包括所述TGF-β抑制剂。


9.一种多能性干细胞来源间充质干细胞的制备方法，其包括：培养已分离的多能性干细胞；以及
将所述培养的多能性干细胞在含有DNA修复剂和ROCK抑制剂的培养基中培养以诱导分化为间充质干细胞。


10.如权利要求9所述的方法，其进一步包括：在TGF-β抑制剂存在的情况下，将所述培养的胚胎干细胞分化为中胚层细胞。


11.如权利要求9所述的方法，其进一步包括：将所述诱导分化的间充质干细胞在间充质干细胞成熟培养基中培养；或者对所述成熟培养基中培养的间充质干细胞进行传代培养。


12.如权利要求9所述的方法，其中，所述培养已分离的多能性干细胞的步骤为在支持细胞不存在的情况下，在涂覆有细胞粘附功能增强剂的培养容器中培养。


13.如权利要求9所述的方法，其不包括：形成胚状体。


14.如权利要求9所述的方法，其中，所述DNA修复剂为3-[(苄基氨基)磺酰基]-4-溴-N-(4-溴苯基)苯甲酰胺或4-溴-N-(4-溴苯基)-3-[[(苯基甲基)氨基]磺酰基]-苯甲酰胺。


15.如权利要求9所述的方法，其中，所述ROCK抑制剂为选自法舒地尔、利帕舒地尔、4-((R)-1-氨乙基)-N-(吡啶-4-基)环己甲酰胺、4-(1-氨乙基)-N-(1H-吡咯并(2,3-b)吡啶-4-基)环己甲酰胺二盐酸盐、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)...

【专利技术属性】
技术研发人员：李东律，李定恩，郑寿敬，朴卿顺，朴志勋，
申请(专利权)人：车比奥泰有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR