一种调控STAT3磷酸化的髓系间充质干细胞上清液及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种利用鼠髓系间充质干细胞上清液通过磷酸化STAT3促进巨噬细胞Raw264.7 M1型向M2型极化的方法。M2型巨噬细胞能分泌多种抑炎因子，从而达到在炎症反应后期发挥抗炎作用。本发明专利技术制备的髓系间充质干细胞上清液对STAT3磷酸化的方法可应用于缓解炎症作用。

【技术实现步骤摘要】
一种调控STAT3磷酸化的髓系间充质干细胞上清液及其应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种干细胞上清液制备方法，尤其涉及一种调控STAT3磷酸化的髓系间充质干细胞上清液制备方法及其应用。
技术介绍
炎症是免疫细胞对病原微生物发生的免疫反应，也是人体中对外源性入侵的微生物的一种防御反应。炎症是机体产生免疫反应的一种表现，但炎症对机体的健康会造成伤害。巨噬细胞在炎症发生的过程中，扮演着重要的作用，它是免疫的第二道防线，能够吞噬、杀伤和清除外源性病原微生物。据报道巨噬细胞具有炎症消退、组织修复等功能。巨噬细胞其功能发挥与周围微环境相关，微环境中的细胞因子、微生物等可以导致巨噬细胞向不同的方向极化，从而发挥不同功能。巨噬细胞的M1型和M2型表型已被公认，M1型和M2型两亚型功能相反，M1型能够产生多种促炎因子，比如肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，INOS），而M2型巨噬细胞产生多种抑炎因子，缓解炎症(Macrophageactivationandpolarization:nomenclatureandexperimentalguidelines,MURRAYPJ)。巨噬细胞存在一系列连续的功能状态，M1型和M2型是连续状态的两个极端，在不同条件下，这两种极端可以相互转化。Nahrendor等发现在急性心肌梗死过程中巨噬细胞的M1/M2表型会转化。骨髓间充质干细胞（bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell，BMSC）是从骨髓中提取的一类间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC）。间充质干细胞是一种具有分化能力的多能干细胞，能够分化为骨、软骨、脂肪、肌肉等多种组织细胞，同时具有促进伤口愈合与再生的能。它主要来源于脐带、脂肪、骨髓等。间充质干细胞具有低免疫原性，对机体中的免疫细胞具有重要的免疫调控作用。有研究证实，MSCs主要通过影响参与炎症反应的免疫细胞增殖、分化和炎性因子分泌，但是其免疫调控机制复杂，尚未完全明确。本专利技术利用培养鼠骨髓间充质干细胞培养液（BMSC-CM）处理M1型巨噬细胞Raw264.7细胞，所制备的髓系间充质干细胞上清液对STAT3磷酸化的方法可应用于缓解炎症作用。
技术实现思路
本专利技术提供了在炎症中鼠髓系间充质干细胞上清液具有消炎作用的应用，具体来说是提供鼠髓系间充质干细胞在LPS诱导的炎症中对巨噬细胞M1型向M2型极化起到促进作用。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：鼠髓系间充质干细胞上清液治疗LPS诱导的炎症的应用。本专利技术中，所述鼠髓系间充质干细胞来源三周龄C57BL/6鼠股骨与胫骨中的骨髓系间充质干细胞。本专利技术中，所述LPS诱导产生炎症的细胞是Raw264.7巨噬细胞。本专利技术中，鼠髓系间充质干细胞上清液处理Raw264.7是利用收集上清液后按1：1比例加入DMEM/F12配制而成的MSC-CM来培养Raw264.7细胞。本专利技术中，利用WesternBlot检测各组Raw264.7巨噬细胞的极化基因STAT3和p-STAT3蛋白质相对表达量，结果显示利用MSC-CM处理的巨噬细胞p-STAT3蛋白相对表达量比DMEM处理组高，这一结果提示鼠髓系间充质干细胞上清液具有消炎作用。与现有技术相比，本专利技术新颖之处为：本专利技术中，利用三周龄C57BL/6鼠的股骨与胫骨分离出的骨髓系间充质干细胞活力与增值能力比较强，且分化程度低。本专利技术所选的骨髓系间充质干细胞上清液是第一次用于探究巨噬细胞M1型向M2型极化的研究，结果显示促进STAT3磷酸化使M1型巨噬细胞向M2型极化，从而达到修复创伤以及消除炎症的功能。附图说明图1为检测STAT3和p-STAT3蛋白表达水平和IL-10mRNA表达水平图。具体实施方案实施例1：提取分离C57BL/6小鼠的骨髓系间充质干细胞。选取雌雄不限的3周龄C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死。用75%酒精浸泡处死的小鼠1min，取小鼠股骨和胫骨放置在盛有预冷的PBS的培养皿中，用PBS清洗股骨与胫骨2次，洗去附着在上面的小块的肌肉组织。将股骨与胫骨的两侧骨端剪去，用1mL的注射器吸入含有10%FBS的DMEM/F12培养液从股骨或胫骨的一侧打出至培养皿中，重复冲洗直至股骨或胫骨发白。将冲洗的培养液收集离心，800g，5min，弃掉上清液，用10%FBS的DMEM/F12培养液重悬，放置在37℃、5%CO2的培养箱中培养。此后每间隔8h，更换培养液，此步骤重复3次，此步骤是将造血干细胞、红细胞等悬浮的细胞去除得到纯的骨髓间充质干细胞。常规培养至细胞达到80%-90%融合时进行传代。重悬细胞培养24h对细胞进行换液后，在显微镜下观察可见细胞贴壁生长，多数细胞呈圆形，部分呈不规则形状；培养至第4d时，显微镜视野下细胞之间间隙较宽，细胞摊开伸出伪足向梭形形状生长；培养至第7d时，细胞大多数呈梭形，且细胞开始聚集；培养至第10d时，细胞呈梭形且形态均一，细胞聚集呈漩涡状。第一代细胞细长呈长梭形，胞体小，并伪足较少；第五代和第十代，细胞形态、细胞大小、伪足数量和第一代比较无明显变化，细胞均呈梭形，汇合时呈漩涡状，细胞活力高，增殖速度较快。实施例2：骨髓间充质干细胞培养上清液（BMSC-CM）的制备。骨髓间充质干细胞传代至第2、3代，当细胞80%-90%融合时，使用DMEM培养液培养，24h后吸取培养液，24000g离心10min，取上清液，保存于-20℃，细胞常规传代。实施例3：MSC-CM对LPS诱导的Raw264.7细胞IL-10mRNA水平以及STAT3和p-STAT3蛋白表达的影响。Raw264.7细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养液常规传代培养。试验分为DMEM培养组（DMEM组）、BMSC-CM培养组（BMSC-CM组）、LPS刺激DMEM培养组（LPS+DMEM组）、LPS刺激BMSC-CM培养组（LPS+BMSC-CM组）。当Raw264.7细胞融合至50%时，DMEM组和BMSC-CM组常规换液，LPS+DMEM组和LPS+BMSC-CM组更换添加1μg/mLLPS的DMEM培养液培养，12h后，DMEM组和LPS+DMEM组更换DMEM培养液培养，BMSC-CM组和LPS+BMSC-CM组更换含50%BMSC-CM的DMEM培养液培养。培养48h，提取总RNA进行半定量PCR，提取总蛋白进行Western蛋白质印迹试验。M2型巨噬细胞可高分泌IL-4和IL-10等细胞因子，因此推测可能与IL-10/STAT3信号通路有关。半定量PCR检测IL-10mRNA水平和Westernblot检测p-STAT3和STAT3蛋白水平。结果如图1所示，两组MSC-CM处理的Raw264.7的IL-10mRNA水平相对比其他两组表达明显上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗炎症髓系间充质干细胞上清液的制备，其包括的步骤为：选取雌雄不限的3周龄C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死；用75%酒精浸泡处死的小鼠1 min，取小鼠股骨和胫骨放置在盛有预冷的PBS的培养皿中，用PBS清洗股骨与胫骨2次，洗去附着在上面的小块的肌肉组织；将股骨与胫骨的两侧骨端剪去，用1 mL的注射器吸入含有10%FBS的DMEM/F12培养液从股骨或胫骨的一侧打出至培养皿中，重复冲洗直至股骨或胫骨发白；将冲洗的培养液收集离心，800 g，5 min，弃掉上清液，用10%FBS的DMEM/F12培养液重悬，放置在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养；此后每间隔8 h，更换培养液，此步骤重复3次，此步骤是将造血干细胞、红细胞等悬浮的细胞去除得到纯的骨髓间充质干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗炎症髓系间充质干细胞上清液的制备，其包括的步骤为：选取雌雄不限的3周龄C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死；用75%酒精浸泡处死的小鼠1min，取小鼠股骨和胫骨放置在盛有预冷的PBS的培养皿中，用PBS清洗股骨与胫骨2次，洗去附着在上面的小块的肌肉组织；将股骨与胫骨的两侧骨端剪去，用1mL的注射器吸入含有10%FBS的DMEM/F12培养液从股骨或胫骨的一侧打出至培养皿中，重复冲洗直至股骨或胫骨发白；将冲洗的培养液收集离心，800g，5min，弃掉上清液，用10%FBS的DMEM/F12培养液重悬，放置在...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡灵玉，向双林，李志伟，周号悦，刘湘粤，何漪，胡翔，
申请(专利权)人：湖南省南华生物医药研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43