一种生产霉酚酸的发酵培养基及发酵方法技术

一种生产霉酚酸的发酵培养基，所述发酵培养基包含甲硫氨酸、碳源和氮源，所述氮源不包含复合有机氮源。本发明专利技术所述的发酵培养基及发酵方法明显提高了利用短密青霉菌生产霉酚酸的效价，尤其是甲硫氨酸浓度为1.5g/L时，可使发酵效价提高到9214μg/mL，补料工艺的开发可使发酵效价达13506ug/ml。

【技术实现步骤摘要】
一种生产霉酚酸的发酵培养基及发酵方法
本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种生产霉酚酸的发酵培养基及发酵方法。
技术介绍
霉酚酸（Mycophenolicacid，MPA，又名麦考酚酸）是一种具有抗真菌、抗肿瘤及免疫抑制作用的抗生素，其对次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶具有可逆性抑制作用，并对淋巴细胞活性起选择性抑制作用；霉酚酸的酯化衍生物--吗替麦考酚酯（Mycophenolatemofetil,MMF）作为新一代免疫抑制剂被广泛应用于器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗中；MPA做为合成MMF的前体化合物，提高MPA的工业化水平对于生产企业来说十分重要。霉酚酸的发酵技术和其他抗生素工业化生产方式相同，由传统的固态培养基发酵转变为液态深层发酵方式，美国专利US4452891提到，短密青霉在27℃振荡条件下培养6天，霉酚酸的产量为2.4g/L，而在27℃非振荡条件下培养14天能达到3.6g/L；Hachiro进行菌种诱变后，液体发酵水平提高到5.8g/L；高兴蓉等对发酵条件和可利用碳源进行了研究，经优化后摇瓶产量为8.565g/L，但均没有实现工业化生产；中国专利申请CN200810151218.1公开了一种麦考酚酸固态发酵的方法，公开了如下工艺步骤：(1)将经传代培养的青霉菌接入到种子培养基上进行培养，再接入到二级种子培养基上进行培养，得到二级种子液；(2)向一容器中，按质量份数加入非惰性载体1～1.8份，惰性载体1～2份，混合均匀，加入蒸馏水，使容器内相对湿度为65％～95％，火菌0.5～1.5h，冷却全22～28℃，接入0.2～2质量份的所述二级种子液，在24～26℃，相对湿度为70％～95％下培养90～360小时；该固态发酵方法不适用于规模化的工业生产。中国专利申请CN102321697B公开了后期补加利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法，公开了发酵培养基包含如下浓度的组分：葡萄糖(C6H12O6·H2O)80～120g/L、甘氨酸12～15g/L、磷酸二氢钾2～4g/L、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5～1g/L、甲硫氨酸0.5～1g/L，溶剂为蒸馏水，pH值为4.4～4.8，最终效价达5.0g/L。中国专利申请CN102127572B公开了一种利用短密青霉高效累积生产霉酚酸的方法，公开了发酵培养基包含如下浓度的组分：葡萄糖(C6H12O6·H2O)80～120g/L、甘氨酸12～15g/L、磷酸二氢钾2～4g/L、MgSO4·7H2O0.5～1g/L、甲硫氨酸0.5～1g/L，溶剂为蒸馏水，pH值为4.4～4.8；发酵培养分为发酵前期和发酵后期两个阶段，发酵前期为120小时，期间自然发酵不补加任何的培养基，发酵后期向发酵罐中补加甲硫氨酸补料培养基，该甲硫氨酸补料培养基中甲硫氨酸浓度为12.5g/L，补加的速率为0.5～2.0g/L·天，补加时间为24小时，最终效价达5.0g/L。中国专利申请CN101671706B公开了一种麦考酚酸发酵过程的补糖方法，公开了发酵培养基包含如下组分：葡萄糖(C6H12O6·H2O)100g/L，甘氨酸14g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O1g/L，L-蛋氨酸0.5g/L，微量元素溶液(FeSO4·7H2O0.22％，CuSO4·5H2O0.03％，ZnSO4·7H2O0.246％，MnSO4·H2O0.016％，KMnO40.02％)1mL；pH4.5，最终效价达10.26g/L。中国专利申请CN109929890A公开了一种麦考酚酸的发酵工艺，公开了发酵培养基包含如下组分：葡萄糖(C6H12O6·H2O)200～300g/L、甘氨酸4～6g/L、蛋氨酸1～3g/L、蛋白胨4～6g/L、啤酒酵母4～6g/L、葵花籽饼粉10～20g/L、K2HPO4·3H2O1～3g/L、MgSO4·7H2O0.2～0.6g/L、ZnSO4·7H2O2～4g/L、CuSO4·7H2O0.2～0.6g/L、GPE消沫剂0.4～0.6g/L，调节pH至4.0～5.0，最终效价达14.603g/L。但是上述培养基还存在如下技术问题：虽然上述专利申请通过改变发酵培养基的组成和控制发酵过程中的工艺条件，在一定程度上提高了霉酚酸的效价，但是对于工业生产来说，操作复杂，且发酵产率还是偏低；想进一步提高霉酚酸的效价，更好的满足工业生产的需要，需要寻找更多可替代现有技术的发酵培养基及发酵工艺，以获得更高的效价。
技术实现思路
本专利技术提供了一种生产霉酚酸的发酵培养基，所述的发酵培养基中包含甲硫氨酸、碳源、氮源、无机盐、微量元素和泡敌。其中，氮源是微生物生长和产物合成所必需，主要用于菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物的合成，发酵氮源的种类和浓度都是影响发酵效价的关键。优选的，本专利技术所述的氮源不包含复合有机氮源。在本专利技术的一个具体实施方式中，对发酵配方中的复合有机氮源做了初步研究；具体方案如下：在发酵配方中分别加入5g/L的黄豆粉、生豆粉、玉米浆粉、酵母浸出粉、麦芽浸出粉、玉米蛋白粉、玉米粉，结果表明：复合有机氮源对发酵效价有抑制作用。故本专利技术所述氮源不包含复合有机氮源。优选的，本专利技术所述发酵培养基包含甲硫氨酸和氨基乙酸的组合。优选的，所述发酵培养基中包含氨基乙酸10-25g/L；进一步优选的，所述氨基乙酸12.6-15g/L。在本专利技术的一个具体实施方式中，对氨基乙酸对发酵效价的影响做了初步研究；具体方案如下：将发酵配方中氨基乙酸的浓度分别设为10g/L、12.6g/L、15g/L、25g/L、50g/L，其它成分相同，结果表明：浓度为10g/L，效价偏低；浓度为12.6g/L和15g/L时效价水平无差异；浓度为50g/L时，代谢异常，生产水平急剧下降。故本专利技术所述的发酵培养配方中氨基乙酸浓度为12.6-15g/L。优选的，所述发酵培养基中包含甲硫氨酸1.0-2.0g/L；进一步优选的，所述甲硫氨酸1.0-1.5g/L；最为优选的，甲硫氨酸1.5g/L。在本专利技术的一个具体实施方式中，对甲硫氨酸浓度对发酵水平的影响进行了研究，具体方案如下：发酵配方中甲硫氨酸浓度分别设为0.45g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L，碳源、无机盐等其它成分不变，组成不同发酵配方，相同的种子来源接入发酵摇瓶，生长8天后检测发酵水平，结果表明：随着甲硫氨酸用量的增多，前期启动变慢，但后期效价水平在1.5g/L时达到峰值。故本专利技术所述的发酵培养基中甲硫氨酸浓度为0.45g/L～3.0g/L；进一步优选的，所述的发酵配方中甲硫氨酸浓度为1.0g/L～2.0g/L；最为优选的，所述的发酵配方中甲硫氨酸浓度为1.5g/L。优选的，所述发酵培养基包含微量元素，所述的微量元素选自硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜中的一种或两种以上的组合；进一步优选的，所述无机盐选自硫酸亚铁或硫酸亚铁与硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜中的一种或两种以上的组合。在本专利技术的一个具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产霉酚酸的发酵培养基，所述发酵培养基包含甲硫氨酸、碳源和氮源，其特征在于所述氮源不包含复合有机氮源。/n

【技术特征摘要】
1.一种生产霉酚酸的发酵培养基，所述发酵培养基包含甲硫氨酸、碳源和氮源，其特征在于所述氮源不包含复合有机氮源。


2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基以氨基酸为氮源；进一步优选的，所述氮源为氨基乙酸。


3.根据权利要求2所述的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基包含甲硫氨酸和氨基乙酸的组合；进一步优选的，所述发酵培养基中包含甲硫氨酸1.0-2.0g/L，氨基乙酸10-25g/L；最为优选的，所述甲硫氨酸1.0-1.5g/L，氨基乙酸12.6-15g/L。


4.根据权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基包含以下成分：葡萄糖200-250g/L，氨基乙酸10-25g/L，磷酸二氢钾6-10g/L，甲硫氨酸1.0-2.0g/L，微量元素1g/L，泡敌0.3g/L，发酵PH4.5。


5.根据权利要求1-4任一所述的发酵培养基，其特征在于生产霉酚酸的菌株为短密青霉菌广西变种YMS-110。


6.一种发酵短密青霉菌生产霉酚酸的方法，其特征在于所述发酵方法包含种子培养阶段和发酵培养阶段。


7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于所述种子...

【专利技术属性】
技术研发人员：平丽英，安方正，方丽纳，匡春兰，胡坚，张薇，
申请(专利权)人：杭州中美华东制药有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33