一种微囊泡的生产方法、基于该微囊泡的生产方法得到的微囊泡及其应用技术

一种微囊泡的生产方法，涉及生物医药技术领域，包括以下步骤：将细胞进行超声处理；将超声处理后的细胞置于培养箱中培养24小时～72小时，收集细胞上清；将所述细胞上清进行纯化得到所述微囊泡。上述微囊泡的生产方法，利用超声装置刺激细胞，可以大量促进微囊泡的生成，从而提高了细胞来源的微囊泡的产量，有助于微囊泡的进一步临床推广及生物学应用。且，上述微囊泡的生产方法，采用的超声刺激细胞方法对细胞无损伤，适用于多种细胞，包括星型胶质细胞，干细胞等。此外，还提供采用上述微囊泡的生产方法得到的微囊泡及其在药物中应用。

【技术实现步骤摘要】
一种微囊泡的生产方法、基于该微囊泡的生产方法得到的微囊泡及其应用
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种微囊泡的生产方法、基于上述微囊泡的生产方法得到的微囊泡及其应用。
技术介绍
细胞治疗具有广泛的应用价值，包括干细胞疗法，免疫细胞疗法等。外泌体(exosomes)，一种小的脂质微囊泡(microvesicles),尺寸在50-150nm，在生理和病理中起着至关重要的作用。作为一种活跃的生物容器，外泌体通过在细胞之间转移蛋白质和遗传信息来介导细胞间的通讯。细胞来源的外泌体/微囊泡不仅可以避免免疫排斥反应，还方便储存，在再生医学中具有极大的应用价值。目前收集外泌体/微囊泡的方法是通过培养细胞，大量收集细胞上清，分离提取，成本昂贵。外泌体的产量严重限制其在生物医药领域的应用。然而细胞外泌体/微囊泡的产量较低严重限制了其应用及进一步的临床推广。如何无创促进外泌体/微囊泡的产量具有重要的科研和应用价值。目前已有的技术中有报道利用冲击波疗法促进外泌体的分泌，文献发表在Cardiovascularresearch。在该方案中，利用冲击波疗法刺激内皮细胞，产生的外泌体携带miR-19a-3p，可以改善心肌缺血的部分功能。传统的技术的缺点是冲击波的机械作用可能对细胞有损伤，且文献中显示结果仅对内皮细胞有效。
技术实现思路
鉴于此，有必要提供一种对细胞无损伤，适用于多种细胞的微囊泡的生产方法、基于上述微囊泡的生产方法得到的微囊泡及其应用。一种微囊泡的生产方法，包括以下步骤：将细胞进行超声处理；将超声处理后的细胞置于培养箱中培养24小时～72小时，收集细胞上清；将所述细胞上清进行纯化得到所述微囊泡。在一个实施例中，将细胞进行超声处理前还包括以下步骤：将细胞培养在二氧化碳培养箱中，培养的温度为37℃；当所述细胞的浓度大于等于70％后，将细胞置于无血清培养基上。在一个实施例中，超声能量区间为0.2W/cm2-4W/cm2，超声处理时间为1s-10min。在一个实施例中，超声处理采用的超声装置包括信号发生器、功率放大器和超声探头，所述功率放大器和所述信号发生器连接，所述超声探头和所述功率放大器连接，所述超声探头为聚焦探头或非聚焦探头或阵列探头，频率为200KHz-5MHz。在一个实施例中，将所述细胞上清进行纯化得到所述微囊泡的步骤为：将所述细胞上清进行多次离心处理，得到所述微囊泡；或将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着进行超滤处理，得到所述微囊泡；或将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着加入微囊泡提取试剂进行沉淀反应，再次离心后，得到所述微囊泡。在一个实施例中，将所述细胞上清进行多次离心，得到所述微囊泡的操作为：将所述细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体；将所述第一液体在转速为1500g-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体；将所述第二液体在转速为9000g-15000g的条件下离心45-90分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体；将所述第三液体在转速为90000g-120000g的条件下离心50-120分钟，去除第五沉淀后，得到所述微囊泡。在一个实施例中，将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着进行超滤处理，得到所述微囊泡的操作为：将所述细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体；将所述第一液体在转速为1500g-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体；将所述第二液体在转速为9000g-12000g的条件下离心45-90分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体；将所述第三液体在100KDa超滤管中离心50-120分钟，去除第五沉淀后，得到所述微囊泡。在一个实施例中，将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着加入微囊泡提取试剂进行沉淀反应，再次离心后，得到所述微囊泡的操作为：将所述细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体；将所述第一液体在转速为1500g-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体；将所述第二液体在转速为9000g-12000g的条件下离心60分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体；按照所述第三液体和微囊泡提取试剂的体积比为1:5的比例，往第三液体中加入微囊泡提取试剂，反应12-24h小时；在转速为3000g-12000g的条件下离心60分钟，保留第五沉淀；往所述第五沉淀中加入PBS溶液，在转速为9000g-12000g的条件下离心60分钟，去除第六沉淀后，得到所述微囊泡。一种微囊泡，所述微囊泡采用上述的微囊泡的生产方法得到。一种采用上述的微囊泡的生产方法得到的微囊泡在药物中的应用。上述微囊泡的生产方法，利用超声装置刺激细胞，可以大量促进微囊泡的生成，从而提高了细胞来源的微囊泡的产量，有助于微囊泡的进一步临床推广及生物学应用。且，上述微囊泡的生产方法，采用的超声刺激细胞方法对细胞无损伤，适用于多种细胞，包括星型胶质细胞，干细胞等。附图说明图1为一实施方式的微囊泡的生产方法的流程示意图；图2为一实施方式的将细胞上清进行多次离心，得到微囊泡的操作流程示意图；图3为一实施方式的将细胞上清进行多次离心处理后，接着进行超滤处理，得到微囊泡的操作流程示意图；图4为一实施方式的将细胞上清进行多次离心处理后，接着加入微囊泡提取试剂进行沉淀反应，再次离心后，得到微囊泡的操作流程示意图；图5为外泌体颗粒数目表征图；图6为实施例1和对比例1的微囊泡总数量；图7为超声刺激后的细胞增殖情况。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本专利技术实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本专利技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本专利技术的范围，而是仅仅表示本专利技术的选定实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。下面结合附图，对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。如图1所示，一实施方式的微囊泡的生产方法，包括以下步骤：S10、将细胞进行超声处理。在一个实施例中，将细胞进行超声处理前还包括以下步骤：S1、将细胞培养在二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微囊泡的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：/n将细胞进行超声处理；/n将超声处理后的细胞置于培养箱中培养24小时～72小时，收集细胞上清；/n将所述细胞上清进行纯化得到所述微囊泡。/n

【技术特征摘要】
1.一种微囊泡的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
将细胞进行超声处理；
将超声处理后的细胞置于培养箱中培养24小时～72小时，收集细胞上清；
将所述细胞上清进行纯化得到所述微囊泡。


2.如权利要求1所述的微囊泡的生产方法，其特征在于，将细胞进行超声处理前还包括以下步骤：
将细胞培养在二氧化碳培养箱中，培养的温度为37℃；
当所述细胞的浓度大于等于70％后，将细胞置于无血清培养基上。


3.如权利要求1所述的微囊泡的生产方法，其特征在于，超声能量区间为0.2W/cm2-4W/cm2，超声处理时间为1s-10min。


4.如权利要求1所述的微囊泡的生产方法，其特征在于，超声处理采用的超声装置包括信号发生器、功率放大器和超声探头，所述功率放大器和所述信号发生器连接，所述超声探头和所述功率放大器连接，所述超声探头为聚焦探头或非聚焦探头或阵列探头，频率为200KHz-5MHz。


5.如权利要求1所述的微囊泡的生产方法，其特征在于，将所述细胞上清进行纯化得到所述微囊泡的步骤为：
将所述细胞上清进行多次离心处理，得到所述微囊泡；或
将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着进行超滤处理，得到所述微囊泡；或
将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着加入微囊泡提取试剂进行沉淀反应，再次离心后，得到所述微囊泡。


6.如权利要求5所述的微囊泡的生产方法，其特征在于，将所述细胞上清进行多次离心，得到所述微囊泡的操作为：
将所述细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体；
将所述第一液体在转速为1500g-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体；
将所述第二液体在转速为9000g-15000g的条件下离心45-90分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体；
将所述第三液体在转速为9...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓志婷，严飞，郑海荣，肖杨，李飞，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44