一种重组质粒、包含其的基因工程菌及其在制备碳酸二甲酯中的应用制造技术

本申请涉及一种重组质粒、包含其的基因工程菌及其在制备碳酸二甲酯中的应用。本申请的基因工程菌可以表达包含E83V、D92N或两者的突变的脂肪酶突变体，在催化甲醇与碳酸丙烯酯或碳酸乙烯酯进行转酯反应制备碳酸二甲酯中，表现出转化率高、选择性高、普适性高的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种重组质粒、包含其的基因工程菌及其在制备碳酸二甲酯中的应用
本专利技术属于生物化工领域，具体涉及一种重组质粒、由其表达的脂肪酶突变体及其在制备碳酸二甲酯中的应用。
技术介绍
碳酸二甲酯简称DMC，常温时是一种无色透明、略有气味的液体，熔点4℃，沸点90.1℃，密度1.0699/cm3，难溶于水，但可以与醇、醚、酮等几所有的有溶剂混溶。碳酸二甲酯性能优良，用途广泛，除用于甲基化、羰基化和碳基甲氧基化反应外，从DMC出发还可制备多种衍生物，如高性能的树脂、溶剂、染料中间体、药物、香料、润滑油添加剂等。碳酸二甲酯具有无毒、对环境影响小的特性，属于新型的“绿色”化工原料，被称为21世纪有机合成的“新基石”，并在近年来取得了迅猛的发展。DMC现有几种生产工艺，存在以下缺陷：光气法污染严重，剧毒物的使用不符合绿色化工要求，已经被淘汰；氧化羰基化法反应条件苛刻，设备投资较大，工艺操作费用高，CO的引入有潜在爆炸危险；酯交换法单程转化率低，需大回流比提高反应物转化率，能耗高，另外，副产物二元醇受到市场条件限制，影响经济效益。酶作为一种生物催化剂，近年来已被人们广泛应用于食品生产与检测、环保技术、生物技术、生物医药等领域。目前研究和应用最广泛的脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一类能催化油脂和短链醇进行转酯化反应生成脂肪酸甲酯的生物催化剂，脂肪酶所介导的反应具有反应条件温和、醇用量小、产品易收集纯化、无污染物排放等优点。目前国内外用于转酯化研究的脂肪酶主要为诺维信公司生产的Novozym435，此酶为树脂固定化酶，载体为大孔丙烯酸树脂，价格高昂，不利于酶法制备化工原料的工业化生产。虽然已有专利报道使用脂肪酶催化甲醇与碳酸乙烯酯或甲醇与碳酸丙烯酯进行转酯反应制备碳酸二甲酯，但反应时间较长，酶活性有待提高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可高效催化制备碳酸二甲酯的基因工程菌，本专利技术提供的基因工程菌可以表达突变脂肪酶，从而有效提高制备碳酸二甲酯的效率，应用前景广阔。一方面，本专利技术提供一种重组质粒，其在酶切位点EcoRI和HindIII之间包含用于表达脂肪酶突变体的核苷酸序列，其中所述序列选自SEQIDNO：3、SEQIDNO：7和SEQIDNO：9。另一方面，本专利技术提供一种上述重组质粒的制备方法，所述方法包括：1)将PEL编号为GenBank:AF284064.1的基因序列通过全基因合成，并连接在质粒pET-28a上，酶切位点为EcoRI和HindIII，获得质粒pET28a-PEL；2)以质粒pET28a-PEL为模板，以下列引物对之一进行高保真PCR扩增：引物对1：83正向:5’GCTCTCATCACTCCTGTGCTCTCGGGCGTGACT3’(SEQIDNO：1)83反向:5’AGTCACGCCCGAGAGCACAGGAGTGATGAGAGC3’(SEQIDNO：2)；引物对2：92正向:5’ACTTTCCCCTCTAATGTGAAGATCATG3’(SEQIDNO：5)92正向:5’CATGATCTTCACATTAGAGGGGAAAGT3’(SEQIDNO：6)；3)PCR之后通过琼脂糖电泳验证PCR产物大小，异丙醇沉淀回收PCR产物，DpnI酶切去除模板，转化大肠杆菌后提取得到包含E83V或D92N突变酶基因的重组质粒，或者所述方法包括：在上述步骤3)之后，以与前次所用引物对不同的引物对重复步骤2)和3)，，也即，如果第一次PCR扩增采用引物对1，则在述步骤3)之后，采用引物对2重复步骤2)和3)，如果第一次PCR扩增采用引物对2，则在述步骤3)之后，采用引物对1重复步骤2)和3)，以获得包含E83V和D92N双突变酶基因的重组质粒。在具体实施方式中，步骤2)中的PCR条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸6min，25个循环，72℃延伸6min。另一方面，本专利技术提供了一种催化制备碳酸二甲酯的基因工程菌，所述基因工程菌包含上述重组质粒。在具体实施方式中，所述基因工程菌为以大肠杆菌为出发菌株，并包含表达脂肪酶突变体的质粒，其中，所述脂肪酶突变体相对于扩展青霉PF898的脂肪酶具有选自以下突变中的任一者或两者组合的突变：第83位谷氨酸突变为缬氨酸(E83V)，以及第92位天冬氨酸突变为天冬酰胺(D92N)。在具体实施方式中，所述脂肪酶突变体，是以扩展青霉脂肪酶的氨基酸序列(GenBank:AAG22769.1)为模板，进行了E83V和D92N的双突变，其具有SEQIDNO：10的序列。另一方面，本专利技术提供一种脂肪酶突变体，所述脂肪酶突变体以上述基因工程菌为发酵菌株进行液体发酵而制备，并包含选自SEQIDNO：4、SEQIDNO：8和SEQIDNO：10的氨基酸序列。再一方面，本专利技术提供一种制备碳酸二甲酯的方法，所述方法包括利用上述基因工程菌进行液体发酵生产脂肪酶突变体以催化制备碳酸二甲酯的步骤。在具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：1)上述基因工程菌种子液按照接种量为培养基体积的1.6％接种于培养基，培养温度为37℃，培养基转速为220rpm，pH6.0-8.0，然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mmol/L，30℃培养7h后，8000rpm，4℃离心5min收集菌体；2)将步骤1)得到的菌体用M9培养基重悬获得菌液；以及3)将甲醇与碳酸丙烯酯按照摩尔比16:1的比例加入到步骤2)重悬的菌液中，55℃，反应48h。技术效果区别于现有的碳酸二甲酯的制备中存在的转化率低、选择性低、工艺复杂、污染环境的情况，本专利技术使用基因工程菌催化甲醇与碳酸丙烯酯或碳酸乙烯酯进行转酯反应制备碳酸二甲酯，具有以下优点：转化率高、选择性高、普适性高，而且工艺简单、反应条件温和、降低成本、环境友好、应用前景广阔。附图说明图1为本申请实施例1中的质粒pET28a-PELE83V的图谱。图2为本申请实施例3中的质粒pET28a-PELD92N的图谱。图3为本申请实施例5中的质粒pET28a-PELMUT的图谱。具体实施方式下面将结合具体实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：脂肪酶E83V的定点突变脂肪酶来源于扩展青霉(Penicilliumexpansum)PF898，脂肪酶的氨基酸序列编号为GenBank:AAG22769.1，其基因序列PEL编号为GenBank:AF284064.1。将该基因通过全基因合成，并连接在质粒pET-28a上，酶切位点为EcoRI和HindIII，获得质粒pET28本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组质粒，其在酶切位点EcoRI和HindIII之间包含用于表达脂肪酶突变体的核苷酸序列，其中所述序列选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其在酶切位点EcoRI和HindIII之间包含用于表达脂肪酶突变体的核苷酸序列，其中所述序列选自SEQIDNO：3、SEQIDNO：7和SEQIDNO：9。


2.一种如权利要求1所述的重组质粒的制备方法，所述方法包括：
1)将PEL编号为GenBank:AF284064.1的基因序列通过全基因合成，并连接在质粒pET-28a上，酶切位点为EcoRI和HindIII，获得质粒pET28a-PEL；
2)以质粒pET28a-PEL为模板，以下列引物对之一进行高保真PCR扩增：
引物对1：
正向:5’GCTCTCATCACTCCTGTGCTCTCGGGCGTGACT3’(SEQIDNO：1)反向:5’AGTCACGCCCGAGAGCACAGGAGTGATGAGAGC3’(SEQIDNO：2)；
引物对2：
正向:5’ACTTTCCCCTCTAATGTGAAGATCATG3’(SEQIDNO：5)反向:5’CATGATCTTCACATTAGAGGGGAAAGT3’(SEQIDNO：6)；
3)PCR之后通过琼脂糖电泳验证PCR产物大小，异丙醇沉淀回收PCR产物，DpnI酶切去除模板，转化大肠杆菌后提取得到包含E83V或D92N突变酶基因的重组质粒，
或者
所述方法包括：在上述步骤3)之后，进一步以与前次所用引物对不同的引物对重复步骤2)和3)，以获得包含E83V和D92N双突变酶基因的重组质粒。


3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤2)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹斌，牟新东，石健，刘涛，王文久，
申请(专利权)人：源创核新北京新材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11