一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备及性能表征方法技术

一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备及性能表征方法。基于4‑氨基脯氨酸五肽的结构特征，合成了HPV E7抗原肽功能化的五肽衍生物，通过共组装制备得到。同时，将4‑氨基脯氨酸替换成天然脯氨酸，通过共组装制备纳米颗粒多肽疫苗，考察疫苗形貌对疫苗免疫应答的影响。生物实验表明多肽疫苗能够成功诱导树突成熟和抗原呈递并促进T细胞增殖，具有自佐剂功能。细胞摄取实验结果表明纳米纤维多肽疫苗比纳米颗粒多肽疫苗在细胞内具有更长的保留时间，而且其在促进DC成熟，引流淋巴结，T淋巴细胞浸润肿瘤组织以及最终杀伤肿瘤细胞方面具有更优异的性能。与抗PD‑1抗体组合使用，证明了组合治疗策略可以提高纳米纤维肽疫苗治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备及性能表征方法
本专利技术涉及多肽纳米疫苗
，具体涉及一种形貌可控的免疫增强型治疗HPV相关癌症的多肽疫苗的制备方法。技术背景免疫疗法已被证明是一种有前途的癌症治疗策略，因为它能够引起宿主被抑制的天然免疫反应，以防御和根除癌细胞。在过去的几十年中，通过利用诸如癌症疫苗，免疫佐剂，细胞因子或免疫检查点阻断剂之类的疗法来激发内部免疫细胞或直接利用工程化的嵌合抗原受体T细胞疗法，证实了基于该策略的癌症免疫疗法的治疗效果。在这些免疫疗法中，由源自病原体的抗原组成的癌症疫苗不仅能够引发免疫反应以清除已存在的癌细胞，还可以建立免疫记忆来防御进一步的感染。迄今为止，基于纳米药物递送平台的优势，已经开发了无机纳米颗粒，聚合物平台，脂质体和树状聚合物等多种材料用于制备癌症疫苗，以提高其激发免疫应答的能力。尽管癌症疫苗具有巨大的治疗潜力，但由于低免疫应答以及潜在的不良副作用(例如细胞因子释放综合征)一些癌症疫苗的临床应用受到严重阻碍。短肽由有限数量的氨基酸残基组成，由于其出色的生物相容性和组装能力，已被广泛用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法，其特征是：包括纳米纤维多肽疫苗AmpF-E7和纳米颗粒多肽疫苗PF-E7的制备，其中纳米纤维多肽疫苗AmpF-E7包括多肽疫苗AmpF-E7

【技术特征摘要】
1.一种形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法，其特征是：包括纳米纤维多肽疫苗AmpF-E7和纳米颗粒多肽疫苗PF-E7的制备，其中纳米纤维多肽疫苗AmpF-E7包括多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57，多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57是通过将多肽AmpF和AmpFE749-57或多肽AmpF和AmpFE744-57的溶液以90:10的摩尔比混合制备的，最终的总浓度为2mM；纳米颗粒多肽疫苗PF-E7包括多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57，是以90:10的摩尔比混合多肽PF和PFE749-57或PF和PFE744-57的溶液制备得到。


2.根据权利要求1所述的形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法，其特征是：包括在制备多肽疫苗之前，将多肽冻干粉AmpF、PF、AmpFE749-57、AmpFE744-57、PFE749-57和PFE744-57溶解在水中来制备浓度为5mM的不同多肽的储备溶液的步骤。


3.根据权利要求1所述的形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法，其特征是：多肽AmpF、PF，E749-57、E744-57、AmpFE749-57、AmpFE744-57、PFE749-57和PFE744-57是通过标准Fmoc固相肽合成(SPPS)方法合成的。


4.一种权利要求1-3任一项形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法得到的疫苗的表征方法，包括临界聚集浓度、圆二色性光谱、硫黄素T结合测定、原子力显微镜、透射电子显微镜的表征，其特征是：多肽疫苗AmpF-E749-57、AmpF-E744-57、PF-E749-57和PF-E744-57聚集浓度均低于10μM；多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57形成了β-折叠构象，多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57采用无规卷曲构象；多肽疫苗AmpF-E749-57和AmpF-E744-57为纤维状，单根纤维的高度为3nm，多肽疫苗PF-E749-57和PF-E744-57分别形成平均直径为100±20nm和100±10nm的纳米颗粒。


5.一种权利要求1-3任一项形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法得到的疫苗的表征方法，其特征是：
体外细胞毒性分析
通过使用MTT比色法评估了多肽或多肽疫苗AmpF-E7和PF-E7的细胞毒性，选择了正常细胞3T3，树突细胞DC2.4和肿瘤细胞TC-1三种类型的细胞，以考察不同疫苗对不同细胞的毒性，首先将细胞添加至每孔1×104个细胞的96孔细胞培养板中，加入DMEM培养基，其中含有10％胎牛血清(FBS)，1％青霉素-链霉素(PS)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24小时，用DMEM培养基稀释不同多肽原液至浓度为3.125、6.25、12.5、25、50、100、150或200μM，移除96孔板中原始培养基，将不同浓度多肽溶液每孔100μL添加到96孔细胞培养板中，并在培养箱中培养48小时，随后，向细胞中加入MTT溶液，每孔10μL、5mg/mL，孵育4小时后除去培养基并添加DMSO每孔100μL显色，最后通过酶标仪测量492nm波长处的吸光度来评估细胞的活力。


6.一种权利要求1-3任一项形貌可控自佐剂宫颈癌多肽疫苗的制备方法得到的疫苗的表征方法，其特征是：
体外细胞摄取和溶酶体逃逸
将FAM标记的不同的多肽衍生物AmpF-FAM，PF-FAM，E749-57-FAM和E744-57-FAM掺入相应的多肽或多肽疫苗中并保证不同多肽中FAM部分或抗原结构域的浓度一致，就多肽疫苗而言，将多肽AmpF，AmpF-E7和AmpF-FAM或PF，PF-E7和PF-FAM以摩尔比为85:10:5混合，总浓度为2mM，对于五肽而言，将多肽AmpF和AmpF-FAM或PF和PF-FAM以95:5的摩尔比混合，总浓度为2mM，对于抗原肽，将多肽E749-57或E744-57与FAM标记的衍生物以1:1的摩尔比混合，总浓度为200μM；
对于BMDC细胞摄取实验，将MSC诱导分化形成的BMDC铺到48孔细胞培养板中，其中每孔2×105个细胞，加入FAM标记的不同多肽溶液，每孔200μL，利用1640培养基稀释确保所有多肽中FAM部分或抗原结构域的浓度分别为10μM和20μM，在37℃、5％CO2细胞培养箱孵育2，4，6，8，12，16和24小时，收集处理后的BMDC，用PBS离心洗涤三遍，然后通过流式细胞仪分析；
对于DC2.4细胞摄取实验，将DC2.4细胞每孔1×105个细胞和每皿1mL、10％FBS、1％PS、0.1％β-巯基乙醇的DMEM培养基加入共聚焦小皿中，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24小时，除去原培养基后，添加用DMEM培养基稀释的FAM标记的不同多肽溶液，每皿1mL，所有多肽中FAM部分或抗原结构域的浓度分别为10μM和20μM，共孵育2，4，6，8，12，16和24小时，除去培养基后，将剩余的DC2.4细胞用PBS洗涤3次，然后用4％多聚甲醛固定，每皿1mL、室温、20分钟；用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)每皿1mL50nM室温20分钟标记DC2.4细胞的细胞核，以便通过激光共聚焦显微镜对细胞进行成像，另外，在溶酶体逃逸实验中，使用上述相同的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：余志林，宋艳秋，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12