包含抗原肽-佐剂核苷酸缀合体的免疫诱导剂及包含其的药物组合物制造技术

本发明专利技术提供免疫诱导剂及包含其的药物组合物，所述免疫诱导剂包含多核苷酸/肽缀合物作为有效成分，所述多核苷酸/肽缀合物是包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物与具有抗原性的肽借助间隔基键合而成的，所述间隔基以一端侧与多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与具有抗原性的肽共价键合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含抗原肽-佐剂核苷酸缀合体的免疫诱导剂及包含其的药物组合物
本专利技术涉及包含用于诱导抗原肽特异性免疫应答的新型的抗原肽-佐剂核苷酸缀合体的免疫诱导剂及包含其的药物组合物。
技术介绍
通过疫苗来预防感染的基本原理是通过人工模拟感染来诱导获得性免疫，诱导针对特定病原体的抗体的产生和细胞性免疫。在获得性免疫中，已知负责免疫“记忆”的T细胞、B细胞起到核心作用、并且通过DNA重排而实现的抗体可变区的多样性能够对数量庞大的抗原产生特异性免疫反应。另一方面，传统上，白细胞、巨噬细胞、树突状细胞等吞噬细胞起到了核心作用的天然免疫是吞噬病原体、异物的非特异性过程，并认为仅在建立获得性免疫之前起到“暂停”的作用，但随着关于天然免疫的分子机制的研究的推进已明确：在天然免疫中也进行了自身/非自身的特异性识别；并且天然免疫对于获得性免疫的建立是必不可少的。更具体而言，根据最近的研究，明确了：树突状细胞、巨噬细胞、B细胞等抗原呈递细胞中存在的Toll样受体(TLR)家族与各种病原体反应，诱导细胞因子的产生，通过促进初始T细胞分化为Th1细胞、活化杀伤性T细胞等而诱导获得性免疫。一系列的TLR家族所识别的病原体的构成成分多种多样，其中之一是作为TLR9的配体的、具有CpG基序的DNA(CpGDNA)。CpG基序以在中心部排列胞嘧啶(C)和鸟嘌吟(G)、在前后排列各2个嘌呤碱基和嘧啶碱基的6个碱基为基本，是以-PuPu-CG-PyPy-(Pu表示嘌呤碱基，Py表示嘧啶碱基。)所示的序列(人的情况，已知GTCGTT也对TLR9具有配体活性。)，是在哺乳类中少见而在微生物中常常(以通过概率计算出的频率)观察到的碱基序列。另外，哺乳类中，少数存在的CpG基序的大多数被甲基化。在哺乳类中几乎不存在的非甲基化CpG基序具有强大的免疫激活活性(例如，参照非专利文献1～3)。通过内吞作用被摄入细胞内的CpGDNA被吞噬体样内质网中存在的TLR9识别，而强烈诱导Th1反应。Th1反应抑制Th2反应占优势的变态反应，且具有较强的抗肿瘤活性。因此，CpGDNA除了预防感染之外，还可期望作为针对过敏性疾病、肿瘤性疾病的佐剂(例如参照非专利文献4)。然而，将CpGDNA用作免疫疗法的佐剂时，如何避免细胞质、血浆中的核酸酶所致的分解以及与蛋白质的非特异性结合、并且使CpGDNA到达靶细胞的内部成为问题。本专利技术人等着眼于作为新型的基因载体的具有β-1,3-葡聚糖骨架的多糖(以下有时简称为“β-1,3-葡聚糖”。)，迄今为止已发现：β-1,3-葡聚糖与以核酸药物(反义DNA、CpGDNA)为首的多种核酸形成新型的复合体(例如，参照专利文献1、2、非专利文献5～7)。发现：将自然界中以三螺旋存在的β-1,3-葡聚糖溶解于二甲基亚砜(DMSO)等非质子性极性有机溶剂或0.1N以上的碱溶液中而解离为单链后，加入单链的核酸，使溶剂为水或恢复中性，从而形成包含1分子的核酸和2分子的β-1,3-葡聚糖的三螺旋复合体。认为在这种情况下三螺旋复合体中的β-1,3-葡聚糖分子与核酸分子主要通过氢键和疏水性相互作用而形成分子间键(参照非专利文献8)。如上所述，通过使核酸与β-1,3-葡聚糖复合化，从而能够抑制由核酸酶所致的核酸分子的水解、血浆蛋白与核酸的非特异性结合等核酸分子与生物体内蛋白质之间的不期望的相互作用，且能使核酸到达至细胞的内部。利用包含β-1,3-葡聚糖与核酸的复合体、进而具有抗原性的蛋白质的三元复合体，成功地将CpGDNA递送至细胞内(例如，参照专利文献3、4、非专利文献9～11)。然而，上述现有技术存在如下那样的课题。例如，非专利文献11中记载的β-1,3-葡聚糖/具有抗原性的蛋白质/CpGDNA的三元复合体的制造方法中，通过高碘酸氧化而在β-1,3-葡聚糖的侧链的葡萄糖残基上产生甲酰基，通过还原氨基化反应使甲酰基与具有抗原性的肽(以下，有时简称为“抗原性肽”。)的氨基反应，形成β-1,3-葡聚糖与具有抗原性的肽共价键合而成的复合体，但存在收率极低这样的课题。鉴于上述情况，例如，专利文献4中记载的β-1,3-葡聚糖/抗原性蛋白质(具有抗原性的肽)/CpGDNA的三元复合体的制造方法中，通过使在侧链具有甲酰基的β-1,3-葡聚糖与具有抗原性的肽在碱水溶液中反应的同时进行中和、或者在碱水溶液中反应并逐次进行中和，由此改善了β-1,3-葡聚糖的侧链上的甲酰基与具有抗原性的肽的氨基的反应性和收率。然而，肽中存在多个氨基，因此难以控制反应点。因此担心会发生下述问题：具有抗原性的肽的由反应位置而导致的免疫原性差异；与β-1,3-葡聚糖的反应产物变为复杂的混合物而导致难以分离纯化；等。另外，与利用氢键来进行复合体的形成的、β-1,3-葡聚糖与DNA的复合体的形成相比，基于β-1,3-葡聚糖与具有抗原性的肽的共价键形成的复合体形成更为繁杂。在这些方面，专利文献4中记载的β-1,3-葡聚糖/具有抗原性的肽/CpGDNA的三元复合体的制造方法依然在生产率等方面存在课题。鉴于上述课题，作为生产率优异、具有高免疫激活活性的肽/β-1,3-葡聚糖复合体，本专利技术人等提出一种肽/β-1,3-葡聚糖复合体，其特征在于，包含具有β-1,3-葡聚糖骨架的多糖、以及具有抗原性的肽与多核苷酸或多核苷酸衍生物通过共价键键合而成的肽/多核苷酸缀合物，前述肽/多核苷酸缀合物的多核苷酸或多核苷酸衍生物通过氢键与前述具有β-1,3-葡聚糖骨架的多糖结合，形成了具有由前述多核苷酸或多核苷酸衍生物的1根分子链与前述具有β-1,3-葡聚糖骨架的多糖的2根分子链形成的三螺旋结构的复合体(参照专利文献5)。然而，专利文献5中未记载构成肽/β-1,3-葡聚糖复合体的肽/多核苷酸缀合物本身的免疫诱导活性。有几篇报道启示出CpGDNA与具有抗原性的肽或者蛋白质的缀合物的免疫诱导活性(参照非专利文献12、13)。然而，非专利文献12中，虽然通过给予CpGDNA与卵清蛋白(OVA)抗原来源的18～24mer的肽的缀合物而显示出CD8阳性T细胞(CTL)中的OVA抗原呈递活性，但并未显示出明确的CTL细胞毒性作用的诱导。另外，非专利文献13中，虽然通过给予CpGDNA与OVA抗原蛋白质的缀合物而显示出CTL细胞毒性作用的诱导，但给药量高达10μg/小鼠，而且在其制造时，需要通过DNA的化学合成和抗原蛋白的培养/纯化来进行生产及它们的缀合之类的复杂制造工序，因此在低用量下的活性和生产率方面存在课题。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第01/34207号专利文献2：国际公开第02/072152号专利文献3：日本特开2010-174107号公报专利文献4：日本特开2007-70307号公报专利文献5：国际公开第2015/118789号非专利文献非专利文献1:BacterialCpGDNAActivatesImmuneCellstoSignalInfectiousDanger,H.Wagner,Adv.Immunol.,73,329-3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫诱导剂，其包含多核苷酸/肽缀合物作为有效成分，所述多核苷酸/肽缀合物是包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物与具有抗原性的肽借助间隔基键合而成的，所述间隔基以一端侧与所述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与所述具有抗原性的肽共价键合。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180928 JP 2018-1860931.一种免疫诱导剂，其包含多核苷酸/肽缀合物作为有效成分，所述多核苷酸/肽缀合物是包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物与具有抗原性的肽借助间隔基键合而成的，所述间隔基以一端侧与所述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与所述具有抗原性的肽共价键合。


2.根据权利要求1所述的免疫诱导剂，其特征在于，所述具有抗原性的肽的氨基酸长度为5以上且30以下。


3.根据权利要求1或2所述的免疫诱导剂，其特征在于，所述具有抗原性的肽的氨基酸长度为8以上且11以下。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫诱导剂，其特征在于，所述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的聚脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫诱导剂，其特征在于，所述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为15以上且40以下。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫诱导剂，其特征在于，所述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为20以上且30以下。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫诱导剂，其特征在于，所述多核苷酸或多核苷酸衍生物为至少一部分磷酸二酯键被硫代磷酸酯键替换的多核苷酸衍生物。


8.根据权利要求7所述的免疫诱导剂，其特征在于，所述至少一部分磷酸二酯键被硫代磷酸酯键替换的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的50％以上被硫代磷酸酯键替换。


9.根据权利要求7或8所述的免疫诱导剂，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：望月慎一，小泉诚，森田浩司，
申请(专利权)人：公立大学法人北九州市立大学，第一三共株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP