一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物及其应用，所述引物探针组合物包括检测TNNI3基因突变位点c.365T>C的引物和探针，所述引物包括SEQ ID NO.1～2所示的核酸序列，所述探针包括野生型探针和突变型探针，所述野生型探针包括SEQ ID NO.3所示的核酸序列，所述突变型探针包括SEQ ID NO.4所示的核酸序列。所述引物探针组合物具备高特异性和灵敏度，能够针对TNNI3基因新突变位点c.365T>C，利用其进行实时荧光PCR，可实现简便、快速、准确和经济地判断基因型。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物及其应用，尤其涉及一种检测TNNI3基因突变位点c.365T>C的引物探针组合物及其应用。
技术介绍
在心脏中，心室心肌形态上发生变化，数量上增加，造成心室室壁的增厚，而心室的室腔相对空间减小，血容量减少。常见的遗传性心肌肥厚的原因是肥厚型心肌病，肥厚型心肌病(Hypertrophiccardiomyopathy，HCM)是一种原发性的心肌疾病，表现为不明原因的左心室和/或右心室以及室间隔非对称性的肥厚，临床表现多样，可以无症状，亦可表现为心衰、心律失常、猝死等恶性心脏事件。研究表明HCM为常染色体显性遗传的单基因疾病，即后代只要继承了父母任何一方(患病者)的含突变基因的染色体即可能发病，已经发现至少15个致病基因、超过700个突变位点与HCM发病有关。TNNI3基因编码心脏特异性蛋白，只在心肌中表达，该基因定位于19q13.4，8个外显子共编码210个氨基酸残基的肌钙蛋白，是HCM的主要致病基因之一。研究表明，TNNI3基因突变的分子机制是通过突变改变了横桥的动力，在一定范围内降低了肌原纤维对Ca2+的敏感性以及Ca2+激活，增加了肌肉收缩时能量的消耗，从而影响心肌细胞的舒张功能和心肌收缩力，使心肌细胞产生代偿性肥大，最终导致HCM的发生。对于心肌肥厚疾病的鉴别诊断传统的方法主要依靠临床表现、心电图、超声心动图和心脏核磁，但传统诊断方法存在明确诊断时间晚(症状出现后)、容易发生误诊、难以判断预后等问题。基因诊断的优势在于：特异性高，明确致病基因突变后，能够100％确诊；早期诊断，即可在症状出现前或不可逆病理改变前作出诊断；能够根据基因型判断良恶性临床转归和预后，提供针对性的“个体化治疗”；可根据基因型提供遗传咨询和生育指导。CN102965428A公开了一种检测遗传性心肌肥厚相关基因突变样品制备试剂盒，针对基因ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR和VCL全部外显子片段，但依赖大规模基因测序平台，过程十分繁琐，耗时较长，且价格十分昂贵。综上所述，建立一种简便、快速、经济和准确的突变筛查方法，对于HCM的预防、辅助临床诊断和预后评估具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物及其应用，利用所述引物探针组合物进行实时荧光PCR，根据荧光信号结果即可判断突变基因型，便捷且经济，对于HCM的预防、辅助临床诊断和预后评估具有重要意义。为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括检测TNNI3基因新突变位点c.365T>C(基因的编码区第365位碱基T突变为C)的引物和探针，所述引物包括SEQIDNO.1～2所示的核酸序列，所述探针包括野生型探针和突变型探针，所述野生型探针包括SEQIDNO.3所示的核酸序列，所述突变型探针包括SEQIDNO.4所示的核酸序列。SEQIDNO.1(正向引物)：5’-CAACAACACACACCACGTTCCTC-3’。SEQIDNO.2(反向引物)：5’-AAGTCCCAGCCATCTCACCCTA-3’。SEQIDNO.3：GTCACCAAGAACATCACGGAGAT。SEQIDNO.4：AGTCACCAAGAACACCACGGAGAT。本专利技术中，所述引物具备高特异性，能够特异性地对包含突变位点的序列(175bp)进行扩增，而所述探针亦具备高特异性，野生型探针和突变型探针分别与野生型位点和突变型位点特异性地结合，同时采用野生型探针和突变型探针，在一次实时荧光PCR反应中即可对基因突变及突变基因型进行判断，从而实现了快速、低成本检测，且检测结果准确性高。优选地，所述探针为Taqman探针。优选地，所述Taqman探针的核酸序列5’端标记有荧光基团。优选地，所述Taqman探针的核酸序列3’端标记有淬灭基团。优选地，所述荧光基团包括FAM或HEX。优选地，所述淬灭基团包括MGB。优选地，所述野生型探针的核酸序列5’端标记的荧光基团与所述突变型探针5’端标记的荧光基团不同。优选地，所述野生型探针的核酸序列5’端标记的荧光基团为FAM。优选地，所述突变型探针的核酸序列5’端标记的荧光基团为HEX。人为二倍体生物，细胞中含有两组染色体，因此突变基因型有三种，2个基因中基因的编码区第365位碱基T均突变为C(TNNI3-365CC)，2个基因中基因的编码区第365位碱基T均未发生突变(TNNI3-365TT)，仅1个基因中基因的编码区第365位碱基T突变为C(TNNI3-365TC)，本专利技术中，同时采用带有不同荧光信号的野生型探针和突变型探针，即可根据荧光信号结果判断突变基因型。第二方面，本专利技术提供如第一方面所述的引物探针组合物在制备肥厚型心肌病致病基因检测产品中的应用。第三方面，本专利技术提供一种检测TNNI3基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物。优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液和/或染料。优选地，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、Mg2+缓冲液、dNTPs和水。优选地，所述染料包括Rox校正染料。优选地，所述试剂盒还包括质控品。优选地，所述质控品包括野生型质控品、突变型质控品和杂合突变型质控品。本专利技术的试剂盒包括高特异性和灵敏度的引物探针组合物，以及PCR反应体系，能够便捷地配制实时荧光PCR体系。优选地，所述质控品的制备方法包括以下步骤：(1)以野生型或突变型的基因组作为模板，进行PCR扩增，所述的PCR扩增的引物的核酸序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示，扩增长度为1441bp，PCR扩增的反应程序如表1所示，并对PCR产物进行纯化；SEQIDNO.5：5’-TCCCTCAGACCCAGGAGTCCAGT-3’；SEQIDNO.6：5’-CAACATGTGATGCCCTGAGCATG-3’；表1(3)将纯化后的片段分别克隆到载体上，转化到大肠杆菌中，挑选单克隆，筛选出阳性克隆菌株，提取质粒；(4)利用毛细管电泳仪对含有克隆目的片段后的质粒载体进行毛细管电泳检测；(5)参照hg19人基因组靶基因TNNI3的基因序列为模板，利用DNAstar序列分析软件对变本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括检测TNNI3基因突变位点c.365T>C的引物和探针；/n所述引物包括SEQ ID NO.1～2所示的核酸序列；/n所述探针包括野生型探针和突变型探针；/n所述野生型探针包括SEQ ID NO.3所示的核酸序列；/n所述突变型探针包括SEQ ID NO.4所示的核酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括检测TNNI3基因突变位点c.365T>C的引物和探针；
所述引物包括SEQIDNO.1～2所示的核酸序列；
所述探针包括野生型探针和突变型探针；
所述野生型探针包括SEQIDNO.3所示的核酸序列；
所述突变型探针包括SEQIDNO.4所示的核酸序列。


2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针为Taqman探针；
优选地，所述Taqman探针的核酸序列5’端标记有荧光基团；
优选地，所述Taqman探针的核酸序列3’端标记有淬灭基团；
优选地，所述荧光基团包括FAM或HEX；
优选地，所述淬灭基团包括MGB。


3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述野生型探针的核酸序列5’端标记的荧光基团与所述突变型探针5’端标记的荧光基团不同；
优选地，所述野生型探针的核酸序列5’端标记的荧光基团为FAM；
优选地，所述突变型探针的核酸序列5’端标记的荧光基团为HEX。


4.如权利要求1-3中任一项所述的引物探针组合物在制备肥厚型心肌病致病基因检测产品中的应用。


5.一种检测TNNI3基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的用于检测TNNI3基因突变的引物探针组合物；
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液和/或染料；
优选地，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张世梅，赵跃，
申请(专利权)人：大理大学，
类型：发明
国别省市：云南;53