一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，解决了现有技术中HI蛋白纯化工艺在放大过程中出现纯化收率低，蛋白收获量少的技术问题。它顺次包括下述步骤：（1）菌体破碎，（2）酶切，（3）澄清过滤，（4）SPFF柱层析，（5）SPHP柱层析，（6）Phenyl HP柱层析，（7）G25柱层析，（8）Q HP柱层析，（9）原液制备。本发明专利技术提供的重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，解决了HI蛋白纯化工艺在放大过程中纯化收率低的问题，蛋白收获量高。

【技术实现步骤摘要】
一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法
本专利技术涉及一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法。
技术介绍
HI蛋白，金葡菌Hla是细菌pore-formingbarrel毒素家族最主要的成员，分子量大小为30kD，是金葡菌感染的最主要的致病因子。Hla是一种外毒素，通常由致病性金葡菌特别是MRSA产生。其可通过促使中性粒细胞裂解，以及对上皮细胞的损害而发挥生物学效应，引起菌血症等临床症状。Hla缺失的突变株在侵入性感染动物实验中毒力减弱，致病作用减小。Wardenburg等构建了无毒的缺乏裂解细胞活性的突变体Hla(H35L)，免疫小鼠后诱导产生了高效价的保护性抗体，能够有效中和Hla，从而降低了金葡菌感染后的致死率。表明无裂解特性的无毒Hla突变体可以作为金葡菌疫苗的候选抗原分子。但是，现有技术中的HI蛋白纯化工艺是将破菌液直接经过亲和层析(Glutathione4FF)进行融合蛋白的捕获和酶切，以达到初步纯化目的蛋白的目的，该工艺放大过程中出现纯化收率低，蛋白收获量少(HI抗原蛋白的收率为0.3mg蛋白/g菌左右本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组金黄色葡萄球菌疫苗 HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：顺次包括下述步骤：/n（1）菌体破碎/n将HI菌体用缓冲液溶解，然后破菌、离心，收集上清液；/n（2）酶切/n应用PP酶溶液对步骤（1）中的收集的上清液进行酶切；/n（3）澄清过滤/n将步骤（2）酶切后的菌液调节pH至6.4-6.6，然后将上清使用Cobetter 0.6～0.8μm或Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤，收集过滤液；/n（4）SPFF柱层析/n采用GE SPFF填料装填层析柱，对步骤（3）收集的过滤液进行初纯，得到HI蛋白SPFF洗脱液；/n（5）SPHP柱层析/n采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤（...

【技术特征摘要】
1.一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：顺次包括下述步骤：
（1）菌体破碎
将HI菌体用缓冲液溶解，然后破菌、离心，收集上清液；
（2）酶切
应用PP酶溶液对步骤（1）中的收集的上清液进行酶切；
（3）澄清过滤
将步骤（2）酶切后的菌液调节pH至6.4-6.6，然后将上清使用Cobetter0.6～0.8μm或PallPDH4深层滤板进行澄清过滤，收集过滤液；
（4）SPFF柱层析
采用GESPFF填料装填层析柱，对步骤（3）收集的过滤液进行初纯，得到HI蛋白SPFF洗脱液；
（5）SPHP柱层析
采用GESPHP填料装填层析柱，对步骤（4）得到的HI蛋白SPFF洗脱液进行中度纯化，得到HI蛋白SPHP层析洗脱液；
（6）PhenylHP柱层析
采用GEphenylHP填料装填层析柱，对步骤（5）得到的HI蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，得到HI蛋白phenylHP洗脱液；
（7）G25柱层析
采用G25层析柱对步骤（6）得到的HI蛋白phenylHP洗脱液进行脱盐换液，得到HI蛋白G25层析液；
（8）QHP柱层析
采用QHP层析柱对步骤（7）得到的HI蛋白G25层析液进行层析，得到HI蛋白QHP流穿液；
（9）原液制备
将步骤（8）得到的HI蛋白QHP流穿液进行除菌过滤，得到HI蛋白原液。


2.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述缓冲液为18-22mM的PB缓冲液，所述缓冲液的pH为5.8-6.2；所述菌体与缓冲液的比例为1:9-11，所述菌体以kg计，所述缓冲液以L计。


3.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述上清液与PP酶溶液的体积比为55-65:1；将上清液与PP酶溶液混合均匀后在2～8℃保温酶切3～4h。


4.根据权利要求3所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述PP酶溶液的浓度＞0.5mg/ml。


5.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（4）中，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、中间清洗、洗脱以及收集标准分别为：
层析柱：柱高18-20cm、柱直径200mm、柱体积5.5-6.5L；
缓冲液：SPFF平衡液：20mMPB，pH为6.0；SPFF洗脱液：20mMPB+1MNaCl，pH为6.0；
上样流速：36-72L/h，RT=5-10min；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36-72L/h，平衡体积：5～8CV，至UV值、电导平稳；
中间清洗：清洗流速36-72L/h，洗脱梯度6%B，清洗2CV；
洗脱：洗脱流速36-72L/h，洗脱梯度15%B；
收集标准：收集HI蛋白SPFF洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU时停止收集，记录收集的HI蛋白SPFF洗脱液体积。


6.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：所述步骤（5）中，采用GESPHP填料装填层析柱，对步骤（4）得到的HI蛋白SPFF洗脱液进行中度纯化，得到HI蛋白SPHP层析洗脱液；具体包括下述步骤：
①使用pH为6.0的20mMPB将步骤（4）得到的HI蛋白SPFF洗脱液稀释2-5倍，控制电导率≤6.0ms/cm，搅拌4-6min混合均匀，关闭搅拌；在2～8℃保温，静置状态下放置4～20h，然后将稀释液上清采用Cobetter0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
②采用GESPHP...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈克平，樊钒，刘冬，朱冲，张仁怀，高婧，杜洪波，杨鉴芹，江之永，吴畏，陈传凤，
申请(专利权)人：成都欧林生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51