一种PD-L1抗体及其提取方法技术

一种PD‑L1抗体及其提取方法，涉及一种抗体及其提取方法。本发明专利技术PD‑L1抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PD‑L1抗体的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示；本发明专利技术提取方法为：采用人PD‑L1(程序性死亡配体1)全长蛋白为抗原对鲨鱼进行免疫，然后提取RNA，并采用逆转录试剂盒反转录为cDNA，PCR法扩增获得vNAR区编码基因，再经过筛选、表达和纯化得到PD‑L1抗体。本发明专利技术的PD‑L1分子量小，只有15KD，结构简单，抗体灵敏度达到1ng，极大提高了检测能力，而线性范围提高到1到300ng，很好的提高了适应检测能力范围，信号值大幅提高，从500多提高到2000多，本发明专利技术方法所得到的PD‑L1抗体(鲨鱼抗体)改进了传统抗体的检测能力，增加了检测的准确度。

【技术实现步骤摘要】
一种PD-L1抗体及其提取方法
本专利技术涉及生物医学或生物制药
，尤其涉及一种抗体及其提取方法。
技术介绍
抗体是结合抗原的受体，是指机体在抗原性物质的刺激下所产生的一种免疫球蛋白，它能与相应抗原发生特异性结合。抗体结构由两条重链(H链)与两条轻链(L链)构成(重链与轻链之间通过二硫键相连接)，每条链又可分为可变区(V区)与恒定区(C区)，其中可变区有三个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变，称为高变区(HVR)，由于高变区在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，因而高变区又称为互补决定区(CDR)，不同重链轻链的CDR组合决定了抗体对抗原的特异性。由于发现时间较早，这类抗体被称为传统抗体，来源包括鼠、兔、人以及其他物种。传统抗体分子量较大，是150KD左右，它可以与细菌、病毒或毒素等异源性物质结合而发挥预防和治疗疾病的作用。作为一种及其重要的原材料，传统抗体在科研、医疗、农业、环境、食品、民用等诸多领域应用广泛，具有不可替代的科学以及经济价值。以传统抗体在医疗领域中药物应用为例，近年来，抗体药物以其高特异性成为全球药品市场上炙手可热的药品，它是生物制药产业中最大类别的产品，如今已被成功用于治疗肿瘤、癌症等多种疾病领域。尤其是PD-L抗体，近年来在治疗肿瘤领域大放异彩。再以传统抗体在医疗领域中体外诊断应用为例，体外诊断仅耗费了3％的医疗资源，但是提供了临床诊断超过70％的信息，被称为医生的“眼睛”。抗体是最重要的体外诊断原料之一，广泛用于酶联免疫分析、化学发光免疫分析、胶体金侧向层析、荧光免疫侧向层析等检测平台。PD-L1抗体在诊断领域也有很好的应用。但是目前传统抗体为基础的PD-L1检测存在两个不足，首先其灵敏度仅为50ng左右，其次其线性范围比较窄，在50到200ng之间，目前的PD-L1抗体检测能力有限。
技术实现思路
本专利技术提供了一种PD-L1抗体及其提取方法。本专利技术PD-L1抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，PD-L1抗体的氨基酸序列SEQIDNO.2所示。上述PD-L1抗体的提取方法按照以下步骤进行：采用人PD-L1(程序性死亡配体1)全长蛋白为抗原对鲨鱼进行免疫，然后提取RNA，并采用逆转录试剂盒反转录为cDNA，PCR法扩增获得vNAR区编码基因，再经过筛选、表达和纯化得到PD-L1抗体。本专利技术的PD-L1抗体用人PD-L1(程序性死亡配体1)全长蛋白作为目的抗原，利用条纹斑竹鲨噬菌体抗体库进行抗人PD-L1(程序性死亡配体1)蛋白的抗体筛选，成功获得PD-L1抗体。本专利技术的PD-L1分子量小，只有15KD，结构简单，抗体灵敏度达到1ng,极大提高了检测能力，而线性范围提高到1到300ng，很好的提高了适应检测能力范围，信号值大幅提高，从500多提高到2000多，本专利技术的PD-L1抗体(鲨鱼抗体)改进了传统抗体的检测能力，增加了检测的准确度。本专利技术的PD-L1抗体可以应用在抗体的酶联免疫(ELISA)的检测方法和抗体的免疫印迹(Westernblot)的检测方法，以及抗体开发的治疗性、诊断性、检测性的应用。附图说明图1为鲨抗PD-L1抗体表达考染检测结果；图2为鼠抗和鲨抗WesternBlot比较检测结果图；图3为不同组别鲨抗WesternBlot检测结果图；图4为本专利技术PD-L1抗体(鲨抗)与鼠抗(鼠的PD-L1抗体)比较结果图。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式PD-L1抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，PD-L1抗体的氨基酸序列SEQIDNO.2所示。具体实施方式二：本实施方式PD-L1抗体的提取方法按照以下步骤进行：采用人PD-L1(程序性死亡配体1)全长蛋白为抗原对鲨鱼进行免疫，然后提取RNA，并采用逆转录试剂盒反转录为cDNA，PCR法扩增获得vNAR区编码基因，再经过筛选、表达和纯化得到PD-L1抗体。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：PCR建库上游引物是：TCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCAACTTGAACAAACGGGCACC，建库下游引物是：TGATGGTGCTGGCCGGCCTGGCCTTCATGGGTCAGAATCATGC。其他步骤及参数与具体实施方式二相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是PCR扩增反应条件：95℃2分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，35个循环，72℃10分钟。其他步骤及参数与具体实施方式二相同。实施例1PD-L1抗体的提取方法按照以下步骤进行：一、PD-L1抗原免疫鲨鱼：选择条纹斑竹鲨作为免疫对象，采用人PD-L1(程序性死亡配体1)全长蛋白为抗原对鲨鱼进行5次免疫，每次免疫间隔14天；完成免疫后，采集鲨鱼外周血淋巴细胞，通过TRIZOL法提取RNA，并采用逆转录试剂盒反转录为cDNA；根据条纹斑竹鲨vNAR保守序列设计引物，引物两端带有克隆进pComb3xss载体的SfiI酶切位点，PCR法扩增获得vNAR区编码基因，其中，建库上游引物(SEQIDNO:3)：TCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCCAACTTGAACAAACGGGCACC，建库下游引物(SEQIDNO:4)：TGATGGTGCTGGCCGGCCTGGCCTTCATGGGTCAGAATCATGC，PCR扩增反应条件：95℃2分钟；94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，28个循环，72℃10分钟。将构建好的pComb3xss质粒转化入大肠杆菌，在辅助噬菌体VCSM13系统扩增、包装下，将PD-L1抗体蛋白片段展示在噬菌体的表面，成为单域重链抗体库。二、PD-L1抗体的筛选、富集1)、VCSM噬菌体滴度测定1、单菌落XL1-Blue(大肠杆菌菌株)接种于2×YT/Tet(15μg/ml)培养基，37℃过夜；2、以1:100比例重新接种于新鲜2×YT培养基，37℃至OD600＝0.8；3、将步骤一中的噬菌体(噬菌体储液)进行一系列10倍梯度稀释，溶于0.1ml分装的2×YT培养基中，每个梯度两份，以得到一个每毫升103-105噬菌体的浓度；4、将2×YT上层琼脂融化，每份噬菌体稀释液至少3ml，冷却至50℃；5、将10μl噬菌体液与500μl新鲜XL1-Blue细胞在一个10ml的培养试管中，孵育30分钟之后加入3ml上层琼脂，迅速混匀，立即将上层琼脂混合物倒至LB琼脂平板上，摇晃平板，让上层琼脂铺开，防止上层琼脂凝固，37℃静置过夜；6、噬菌斑的数目乘以100乘以相应的稀释倍数，等于原始储液中的噬菌体的滴度。2)、VCSM13的扩增1、用枪头从过夜培养的平板上挑取一个单噬菌斑，在1ml新鲜XL1-Blue细胞中吹洗，37℃振荡培养1小时；2、吸取100μl培养物在50μg/ml四环素的2×YT50ml中，37℃振荡培养24小时；3、将培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PD-L1抗体，其特征在于PD-L1抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PD-L1抗体的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种PD-L1抗体，其特征在于PD-L1抗体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，PD-L1抗体的氨基酸序列SEQIDNO.2所示。


2.一种PD-L1抗体的提取方法，其特征在于PD-L1抗体的提取方法按照以下步骤进行：采用人PD-L1全长蛋白为抗原对鲨鱼进行免疫，然后提取RNA，并采用逆转录试剂盒反转录为cDNA，PCR法扩增获得vNAR区编码基因，再经过筛选、表达和纯化得到PD-L1抗体。


3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建明，陈锦霖，赵铁铭，
申请(专利权)人：深圳海创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44