一种抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种抗真菌1,3‑β‑D‑葡聚糖单克隆抗体及其应用，所述抗真菌1,3‑β‑D‑葡聚糖单克隆抗体包括SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；所述轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。本发明专利技术的抗真菌1,3‑β‑D‑葡聚糖单克隆抗体对真菌1,3‑β‑D‑葡聚糖具有显著的特异性结合能力，构建的试剂盒特异性好、灵敏度高、准确性佳，在真菌1,3‑β‑D‑葡聚糖检测领域具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体及其应用
本专利技术属于真菌检测
，涉及一种抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体及其应用。
技术介绍
目前，真菌1,3-β-D-葡聚糖检测主要采用鲎试剂法，检测原理为1,3-β-D-葡聚糖特异性激活鲎试剂中的G因子，进而激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶催化显色反应或浊度反应，产生游离的对硝基苯胺(pNA)并引起吸光度变化，通过动态检测溶液吸光度变化率实现对1,3-β-D-葡聚糖浓度的定量检测。该方法总检测时间约50min，线性下限为37.5pg/mL。然而，鲎试剂的关键原料来自国家二级野生保护动物鲎，鲎的生长周期较长、人工养殖率低，通常需要捕捞野生鲎、从鲎血中提取鲎试剂原料。鲎是濒危物种，采用鲎试剂法检测真菌1,3-β-D-葡聚糖已不能满足临床需求，且天然鲎血制备的鲎试剂批间差异大，导致产品生产成本高、再现性较差。此外，鲎试剂在细菌内毒素的作用下同样会激活凝固酶原形成凝固酶，而细菌内毒素广泛存在于自然界中，因此鲎试剂法极易受细菌内毒素的干扰。化学发光检测法因其特异性好、灵敏度高、检测时间短、易于自动化等特点，已广泛应用于生物大分子检测领域。以罗氏公司的PCT检测试剂盒为例，该检测试剂盒采用夹心法，样品、生物素标记抗体和钌复合物标记抗体形成抗体抗原夹心免疫复合物，再添加链霉亲和素磁珠，利用生物素和链霉亲和素的相互作用结合在免疫复合物上；向孵育混合液施加电磁作用，磁珠及免疫复合物吸附在电极表面，未与磁珠结合的物质通过ProCell被去除；向电极施加电压使免疫复合物化学发光，根据化学发光强度分析样品中抗原的浓度。该检测试剂盒检测时间短，仅18min，但是样品中的生物素会干扰生物素标记抗体与链霉亲和素磁珠的结合，影响结果的准确性。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体及其应用，所述抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体对真菌1,3-β-D-葡聚糖具有特异性结合力，稳定性好、批间差异小，构建的基于化学发光的真菌1,3-β-D-葡聚糖检测试剂盒实现了灵敏、特异、准确的定量或半定量检测真菌1,3-β-D-葡聚糖的效果，在判断患者真菌感染程度方面具有重要的应用前景。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体，所述抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括SEQIDNO:1所示的重链CDR1、SEQIDNO:2所示的重链CDR2和SEQIDNO:3所示的重链CDR3；所述轻链可变区包括SEQIDNO:4所示的轻链CDR1、SEQIDNO:5所示的轻链CDR2和SEQIDNO:6所示的轻链CDR3；SEQIDNO:1：SGGNTNQQK；SEQIDNO:2：DSSDPPPMSLLTEV；SEQIDNO:3：NNMDRAVKL；SEQIDNO:4：GLCDETRFEC；SEQIDNO:5：VPSPLAPISKQL；SEQIDNO:6：QANIYSYCSE。本专利技术中，包括SEQIDNO:1～6的CDR的抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体对真菌1,3-β-D-葡聚糖具有显著的特异性结合能力，有利于构建特异、灵敏、准确、低廉的真菌1,3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，在真菌1,3-β-D-葡聚糖检测领域具有重要意义。优选地，所述重链可变区包括SEQIDNO:7所示的氨基酸序列；SEQIDNO:7：QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSSGGNTNQQKWVRQAPGKGLEWIGDSSDPPPMSLLTEVRFTISKTPTTVDLKMTSPTTEDTATHFCARNNMDRAVKLWGPGTLVTVSS。优选地，所述轻链可变区包括SEQIDNO:8所示的氨基酸序列；SEQIDNO:8：ADIVMTQTPSSASEPVGGTVTIKCGLCDETRFECWYQQKAGQPPKRLIYVPSPLAPISKQLGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQANIYSYCSEFGGGTEVVVKG。本专利技术中，含有SEQIDNO:7～8的可变区的抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体特异性好、稳定性好，与真菌1,3-β-D-葡聚糖的亲和力强，可以快速与真菌1,3-β-D-葡聚糖结合，有利于缩短检测时间。优选地，所述抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体还包括恒定区。优选地，所述恒定区包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体修饰有缀合物。优选地，所述缀合物包括化学发光基团、辣根过氧化物酶或荧光基团中的任意一种。第二方面，本专利技术提供了一种第一方面所述的抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)取经真菌1,3-β-D-葡聚糖免疫的实验动物的脾细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞；(2)从制备的杂交瘤细胞中克隆抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体基因，构建含有抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体基因的重组表达载体；(3)将所述重组表达载体导入感受态细胞，从感受态细胞培养上清中分离纯化得到所述抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体。本专利技术中，采用基因工程技术构建稳定表达抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体的细胞株，由此制备的抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体稳定性好、批间差异小，对真菌1,3-β-D-葡聚糖具有强特异性结合力。第三方面，本专利技术提供了一种真菌1,3-β-D-葡聚糖化学发光检测试剂盒，所述真菌1,3-β-D-葡聚糖化学发光检测试剂盒包括检测抗体和信号抗体，所述检测抗体和/或所述信号抗体为第一方面所述的抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体。本专利技术中，采用对真菌1,3-β-D-葡聚糖具有强特异性结合力的抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体作为检测抗体和/或信号抗体构建免疫化学发光检测试剂盒，原料来源广泛、可控、稳定性好，检测方法灵敏度高、准确性好、时间短，样本处理方法简单，解决了传统的鲎试剂法易受内毒素干扰的问题。优选地，本专利技术既可以采用乙二胺四乙酸(EDTA)溶液预处理血清样本、又可以采用酸碱样本释放液预处理血清样本，例如，向血清样本加入EDTA溶液，120℃加热6min，10000g离心10min，获得上清作为检测样本，或向血清样本加入酸性样本释放液室温静置5min、再加入碱性样本释放液进行中和反应，得到检测样本，相较于鲎试剂法的样本处理方法更简单。优选地，所述检测抗体偶联在固相载体上，优选为羧基化固相载体上。本专利技术中，采用羧基化偶联方法将检测抗体修饰在固相载体上，避免依赖生物素-链霉亲和素相互作用，消除了样本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体，其特征在于，所述抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；/n所述重链可变区包括SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:3所示的重链CDR3；/n所述轻链可变区包括SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体，其特征在于，所述抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括SEQIDNO:1所示的重链CDR1、SEQIDNO:2所示的重链CDR2和SEQIDNO:3所示的重链CDR3；
所述轻链可变区包括SEQIDNO:4所示的轻链CDR1、SEQIDNO:5所示的轻链CDR2和SEQIDNO:6所示的轻链CDR3。


2.根据权利要求1所述的抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区包括SEQIDNO:7所示的氨基酸序列；
优选地，所述轻链可变区包括SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体，其特征在于，所述抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体还包括恒定区；
优选地，所述恒定区包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合。


4.根据权利要求1-3任一项所述的抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体，其特征在于，所述抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体修饰有缀合物；
优选地，所述缀合物包括化学发光基团、辣根过氧化物酶或荧光基团中的任意一种。


5.一种权利要求1-4任一项所述的抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)取经真菌1,3-β-D-葡聚糖免疫的实验动物的脾细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞；
(2)从制备的杂交瘤细胞中克隆抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体基因，构建含有抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体基因的重组表达载体；
(3)将所述重组表达载体导入感受态细胞，从感受态细胞培养上清中分离纯化得到所述抗真菌1,3-β-D-葡聚糖单克隆抗体。


6.一种真菌1,3-β-D-葡聚糖化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述真菌1,3-β-D-葡聚糖化学发光检测试剂盒包括检测抗体和信号抗体，所述检测抗体和/或所述信号抗体为权利要求1-4任一项所述的抗真菌1,3-β-D-...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春龙，张舟，张玉静，周泽奇，粟艳，
申请(专利权)人：丹娜天津生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12