一种甲氧苄啶半抗原TMPH、人工抗原、抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种甲氧苄啶半抗原TMPH、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明专利技术首先提供了一种甲氧苄啶半抗原TMPH，进一步利用该甲氧苄啶半抗原TMPH与载体蛋白偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫小鼠，制备得到甲氧苄啶单克隆抗体。本发明专利技术制备得到的抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，其对甲氧苄啶的最低检测限为0.025ng/mL、IC

【技术实现步骤摘要】
一种甲氧苄啶半抗原TMPH、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，更具体地，涉及一种甲氧苄啶半抗原TMPH、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
甲氧苄啶(Trimethoprim，TMP)属于二氨嘧啶类化合物，自1969年抗菌增效剂-甲氧苄啶(TMP)发现以后，将甲氧苄啶与磺胺类药物组成复方制剂，可使细菌的叶酸代谢受到双重阻断，使抗菌谱扩大、抗菌活性增强，从抑菌作用变为杀菌作用，对多数革兰氏阳性菌和阴性菌有效，在兽医临床上应用十分广泛。但磺胺增效剂可导致瘙痒、皮疹，临床也有发现服用头孢羟氨苄/TMP致过敏性休克的报道，也有发生恶心、呕吐、腹泻等胃肠道反应。磺胺增效剂对小白鼠的半数致死量(LD50)为2500mg/kg。大剂量使用时，会影响叶酸代谢和作用，可致白细胞减少和血小板减少，故长期使用时必须注意。为了保护人类健康，控制磺胺类药物和甲氧苄啶的使用，中国、欧盟等国家和组织对它们的最高残留限量做出了规定，我国农业农村部2019年颁布的GB31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》，对磺胺类药物的规定是所有食品动物中脂肪的最大残留限量100μg/kg，对甲氧苄啶的规定是禽的肌肉、皮脂、肝脏、肾脏中的最大残留限量50μg/kg，并且规定日允许量为0～4.2μg/kg。同时，我国农业行业标准《无公害食品水产品中渔药残留限量》(NY5070—2002)中规定了以磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑4种药物按总量计最大残留限量为100μg/kg，甲氧苄啶最大残留限量为50μg/kg。根据调查资料显示，贵州省和重庆市市场监督管理局公布，2020年7～10月，某些企业的鸡肉制品、猪肝样品中出现甲氧苄啶超标的情况。目前磺胺类及其增效剂残留的测定方法有高效液相色谱法配合紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器，但是仪器分析法由于其样本前处理及测定过程繁琐，费用高、需要专业人员操作，不适于大量样本筛查。而酶联免疫吸附检测法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点，适于市场监测和现场监控。基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法主要以单克隆抗体和多克隆抗体为主，具有样本前处理简便、操作简单、快速、灵敏和高通量等特点，被誉为是21世纪最具有竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景，同时，近年来单链抗体与纳米抗体因具有稳定性高和可大量表达的优点，亦受到学者们的青睐。但是，对于免疫分析法而言，抗体作为核心原材料，抗体的效果很大程度是取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。公开号为CN104341357A和CN108059620A的专利公开了一种甲氧苄啶半抗原、抗体，但这些抗原或抗体的检测限都比较高，检测灵敏度较低，难以用于快速准确地检测出食品中的甲氧苄啶残留。因此，提供一种抗原结构稳定、特异性高的抗体以及能够用于快速、灵敏、准确的检测甲氧苄啶的方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有甲氧苄啶检测方法的缺陷和不足，提供一种甲氧苄啶半抗原TMPH、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本专利技术提供的甲氧苄啶半抗原TMPH的合成方法简单，直接利用2-肼基甲氧苄啶的嘧啶环上的肼基进行修饰改造，在分子结构式上的肼基通过与乙醛酸的缩合反应生成，使其末端具有活性基团-羧基。本专利技术的第一个目的是提供一种甲氧苄啶半抗原TMPH。本专利技术的第二个目的是提供所述甲氧苄啶半抗原TMPH的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供所述甲氧苄啶半抗原TMPH在制备甲氧苄啶人工抗原或抗体中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种甲氧苄啶人工抗原。本专利技术的第五个目的是提供所述甲氧苄啶人工抗原在制备甲氧苄啶抗体中的应用。本专利技术的第六个目的是提供一种甲氧苄啶抗体。本专利技术的第七个目的是提供一种酶联免疫检测甲氧苄啶的免疫原与包被原的组合物。本专利技术的第八个目的是提供所述甲氧苄啶半抗原TMPH、所述甲氧苄啶人工抗原或所述免疫原与包被原的组合在检测甲氧苄啶或制备甲氧苄啶检测试剂盒中的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供了一种甲氧苄啶半抗原TMPH，其结构式如式(I)所示：所述甲氧苄啶半抗原TMPH保留了甲氧苄啶原分子的骨架结构，有利于进行免疫诱导，有效地提高了甲氧苄啶半抗原TMPH的免疫原性。本专利技术还提供了所述甲氧苄啶半抗原TMPH的制备方法，是由2-肼基甲氧苄啶与乙醛酸反应制备得到。更优选地，所述甲氧苄啶半抗原TMPH的制备方法为：将溶解于有机溶剂中的乙醛酸与2-肼基甲氧苄啶的甲醇溶液进行反应，直至有白色沉淀析出；固液分离后用有机溶剂洗涤固体，固体干燥后即得甲氧苄啶半抗原TMPH。优选地，所述2-肼基甲氧苄啶和乙醛酸的摩尔比为1：1～3。更优选地，所述2-肼基甲氧苄啶和乙醛酸的摩尔比为1：1.5。优选地，所述有机溶剂为甲醇。优选地，将乙醛酸溶于甲醇中，滴加至2-肼基甲氧苄啶的甲醇溶液中，60℃回流3h后停止反应，继续反应至有白色沉淀析出。优选地，所述固液分离的方法为抽滤。本专利技术要求保护以上所述甲氧苄啶半抗原TMPH在制备甲氧苄啶人工抗原或抗体中的应用。本专利技术还提供了一种甲氧苄啶人工抗原，由以上所述甲氧苄啶半抗原TMPH与载体蛋白偶联得到，其结构式如式(II)所示：优选地，所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白、血蓝蛋白、牛血清白蛋白、乳铁蛋白或刀豆球蛋白。所述甲氧苄啶半抗原TMPH与载体蛋白偶联时，甲氧苄啶半抗原TMPH的特异性结构突出于载体蛋白的表面，作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫系统，为得到特异性高、质量高的抗体奠定了基础。优选地，所述甲氧苄啶人工抗原的制备方法为采用活泼酯法将所述半抗原TMPH与载体蛋白偶联制备得到，具体步骤如下：S1.将甲氧苄啶半抗原TMPH溶于DMF中，然后加入NHS和EDC进行反应；S2.将载体蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中；S3.将步骤S1的溶液与步骤S2的溶液混合进行反应，将反应液进行透析，收集透析液，即制得甲氧苄啶人工抗原。优选地，步骤S1中半抗原TMPH、NHS和EDC的投料摩尔比为1：1～2：1～2。更优选地，步骤S1中半抗原TMPH、NHS和EDC的投料摩尔比为1：1.5：1.5。优选地，载体蛋白与甲氧苄啶半抗原TMPH的摩尔比为1：60。优选地，所述透析的方法为：将反应液于4℃下透析3天，每天换2次透析液，共透析6次。本专利技术要求保护所述甲氧苄啶人工抗原在制备甲氧苄啶抗体中的应用。优选地，所述甲氧苄啶抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或纳米抗体。本专利技术还要求保护一种甲氧苄啶抗体，是以所述甲氧苄啶人工抗原为免疫原制备得到。优选地，所述甲氧苄啶抗体为单克隆抗体。优选地，所述免疫原为半抗原TMPH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甲氧苄啶半抗原TMPH，其特征在于，其结构式如式(I)所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种甲氧苄啶半抗原TMPH，其特征在于，其结构式如式(I)所示：





2.权利要求1所述甲氧苄啶半抗原TMPH的制备方法，其特征在于，是由2-肼基甲氧苄啶与乙醛酸反应制备得到。


3.权利要求1所述甲氧苄啶半抗原TMPH在制备甲氧苄啶人工抗原或抗体中的应用。


4.一种甲氧苄啶人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述甲氧苄啶半抗原TMPH与载体蛋白偶联得到，其结构式如式(II)所示：





5.根据权利要求4所述甲氧苄啶人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白、血蓝蛋白、牛血清白蛋白、乳铁蛋白或刀豆球蛋白。


6.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉栋，谢美婵，杨金易，王弘，徐振林，孙远明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44