一种差向异构酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种差向异构酶的突变体、其编码基因、氨基酸及在生产D

【技术实现步骤摘要】
一种差向异构酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用


[0001]本专利技术涉及一种酶突变体，特别涉及一种差向异构酶的突变体、其编码基因、氨基酸及在生产D
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阿洛酮糖中的应用。

技术介绍

[0002]D
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阿洛酮糖是D
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果糖的碳
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3异构体，是一种罕见的单糖，存在于天然产物中。近年来，D
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阿洛酮糖因其健康益处而受到广泛关注，包括作为低热量甜味剂、肝脏脂肪生成酶和肠道酶糖苷酶的抑制剂减少身体脂肪积累。自然界中，D
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阿洛酮糖的含量极少，且极难获得。来源于野生菌株未经改造的差向异构酶在热稳定性方面较差，工业应用存在一定的局限性，导致酶的使用时间偏短，应用成本偏高，限制了D
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阿洛酮糖的大规模工业化生产。因此，热稳定性好的差向异构酶的资源仍然偏少，不利于D
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阿洛酮糖的工业化应用推广。
[0003]目前已经有多项关于差向异构酶的突变体提高催化果糖生成阿洛酮糖效率或效果的专利申请。专利CN201911384895.2、CN201911378513.5、CN201911204720.9等通过点突变得到耐高温的酶，但最适温度过高，不利于工业生产，最适温度下半衰期短，酶回收利用的价值不大；专利CN201810059404.6、CN201610816801.4、CN201911099450.X等通过点突变和随机突变等方式使酶的半衰期有所延长，其热稳定性有所提高，但反应平衡并没有明显右移，其转化率依然在30％左右。CN201910655539.3得到的突变体酶活有了显著提升，但是其最适温度没有提高，此温度下底物和产物的溶解度有限，限制了工业上高浓度底物的生产，不利于工业放大。
[0004]因此，如何同时提高差向异构酶的热稳定性以及提高其生产D
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阿洛酮糖的效率，使其能够在较高底物浓度下进行催化反应，为酶法工业化生产D
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阿洛酮糖提供有效途径是当前亟需解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的不足之处，本专利技术通过基因工程方法获得了差向异构酶突变体；在提高了差向异构酶突变体的热稳定性同时，使酶的最适温度提高了10
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20℃，并且该突变体在水中就能发挥很好的催化效果，不需要其他缓冲溶液存在，该方法为酶法工业化生产D
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阿洛酮糖提供有效途径。
[0006]本专利技术第一方面提供了一种差向异构酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
[0007]本专利技术第二方面提供了一种差向异构酶突变体，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示；或者所述突变体的基因序列为编码前文所述的差向异构酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0008]本专利技术第三方面提供了一种差向异构酶突变体的构建方法，包括如下步骤；按照随机突变试剂盒获得随机突变体，筛选其中具有优良性能的突变体。该方法中所述试剂盒为市面上可购买到的任意QuickMutationTM基因随机突变试剂盒。
[0009]本专利技术第四方面提供了一种差向异构酶突变体在生产D
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阿洛酮糖中的应用。
[0010]进一步地，所述应用包括将细胞用于D
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阿洛酮糖生产的催化体系中进行反应。
[0011]进一步地，所述D
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阿洛酮糖生产的催化体系包括100～1000g/L果糖，0～576g/L硼酸，前文所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的突变体的全细胞浓度15～45g/L；优选的全细胞浓度为25～35g/L。
[0012]进一步地，所述D
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阿洛酮糖生产的催化体系温度控制在65～90℃范围内，反应pH可在6.5～8.5范围内波动，硼酸浓度可在72～288g/L范围内波动，D
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果糖可在200～800g/L范围内波动；
[0013]对于上文所述的技术方案中，优选的体系温度控制在75～85℃范围内。
[0014]对于上文所述的技术方案中，优选的反应pH可在7.0～8.0范围内。
[0015]对于上文所述的技术方案中，优选的反应硼酸浓度可在72～216g/L范围内。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0017]本专利技术通过基因工程方法获得的差向异构酶突变体E.coli BL21
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pET29(a)
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DTEase
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153
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211和E.coli BL21
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pET29(a)
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DTEase
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203
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237；其性质较野生株有显著提高，体现在以下几方面：(1)突变体的最适温度比原始菌提高了10
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20℃；(2)最适温度下的生产强度是原始菌的1.54倍和1.17倍；(3)酶的热稳定性有显著提高；(4)该突变体无需添加金属离子，可用纯水作为反应溶液，就能发挥很好的催化效果，从而降低了反应成本，同时有利于简化后续纯化工艺，缩减生产周期，对规模化生产有重要意义；(5)突变体在高浓度果糖700g/L为底物的情况下，添加硼酸盐，阿洛酮糖转化率可进一步提高至73.2％。(6)使用全细胞作为催化剂可以去除细胞的破碎、酶的纯化步骤，而且对于性质较好的酶，使用全细胞催化，省去固定化的步骤，更具有产业化可行性。
附图说明
[0018]图1重组大肠杆菌中差向异构酶的SDS
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PAGE分析。其中Lane M:分子量标记；1:阴性对照2:重组菌；3:纯化后差向异构酶；
[0019]图2突变株的最适温度；
[0020]图3热稳定性数据；
[0021]图4不同硼酸添加摩尔比例对阿洛酮糖转化率的影响。
具体实施方式
[0022]下面对本专利技术的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0023]本专利技术中，除非另有其他明确说明，否则百分比、百分含量均以质量计。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
[0024]本申请的实施例中所涉及的酶学性质、热稳定性和半衰期检测方法如下：
[0025]1.酶学性质测定
[0026]酶活定义：1U酶活定义为在60℃下，每分钟催化生产1moL的D
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阿洛酮糖所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)，反应体系包含100g/L果糖，30g/L全细胞，在50mM Tris
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HCl(pH 7.5)中进行反应。HPLC检测D
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阿洛酮糖产量以确定酶活力。
[0027]突变后的酶学性质可能发生改变，探究最佳酶活条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种差向异构酶突变体，其特征在于：编码所述突变体的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的差向异构酶突变体，其特征在于：编码所述突变体的基因序列如SEQ ID NO.2或3所示，或编码所述突变体的基因序列为编码权利要求1所述的氨基酸序列的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的差向异构酶突变体在生产D
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阿洛酮糖中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用包括将差向异构酶突变体细胞用于D
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阿洛酮糖生产的催化体系中进行反应；所述催化体系包括100～1000g/L果糖，0～576g/L硼酸，15～45g/L的如权利要求1所述的差向异构酶突变体的全细胞。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述D
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阿洛酮糖生产的催化体系中全细胞浓度为25～35g/L。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：范超，齐佳琨，袁文杰，袁堂国，洪皓，刘军，吴文忠，
申请(专利权)人：大连医诺生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：