一种纤维二糖差向异构酶的突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种纤维二糖差向异构酶的突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明专利技术通过对嗜热厌氧菌Dictyoglomusthermophilum来源的纤维二糖差向异构酶进行定向进化，得到突变体能仍然具备将乳糖转化为乳果糖的性能，且酶活和底物转化率显著提升，在相同加酶量的条件下，乳果糖转化率最高可达58.2％，较野生型提高了35.35％，具有良好的工业应用性能。具有良好的工业应用性能。具有良好的工业应用性能。

【技术实现步骤摘要】
一种纤维二糖差向异构酶的突变体及其应用


[0001]本专利技术公开了一种纤维二糖差向异构酶的突变体及其应用，属于酶工程


技术介绍

[0002]乳果糖(4
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O
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β
‑
D
‑
galactopyranosyl
‑
D
‑
fructose，Lactulose)又名异构乳糖、乳酮糖或半乳醣果糖，是半乳糖和果糖通过β
‑
1,4
‑
糖苷键结合而成。乳果糖分子式为C
12
H
22
O
11
，与乳糖是同分异构体。乳果糖成品为淡黄色澄明粘稠体，微甜，其结晶体为白色不规则粉末，密度为1.32g/cm3，在水中溶解度76.4％(30℃)，折射率为1.45
‑
1.47。乳果糖甜度相当于乳糖，是蔗糖的48％
‑
60％，口感清凉，粘度较低，热值低，较安全，较稳定，不易发生美拉德反应。
[0003]乳果糖由于其特殊的生理功效，被广泛的应用于药品、食品工业以及饲料工业中。主要包括以下几个方面：
[0004](Ⅰ)乳果糖在医学中的应用。自1960年开始，乳果糖就已被批准作为治疗便秘的药物，且各年龄段人群均可使用。乳果糖类药物还会刺激肠炎病人小肠内低分子量有机酸的合成，降低环境pH，促进有益菌种乳酸菌等生长，抑制感染类细菌的滋生，为治疗肠道感染提供了一种新型的治疗方式。乳果糖通过酸化结肠环境，将自由扩散的氨(NH3)转化为铵离子(NH
4+
)，使其不能扩散回血液，从而降低血氨值，降低肝性脑病的患病率。同时，乳果糖还可以增加人体对食物中矿物质的吸收。
[0005](Ⅱ)乳果糖在食品中的应用。根据国标GB2760
‑
86的规定，乳果糖可以添加到鲜乳、乳粉、奶油粉、饼干、婴幼儿配方食品以及饮料类产品中。乳果糖不会被人体肠道消化吸收，可用作糖尿病患者的甜味剂，也可以替代婴儿奶粉、烘焙产品、酸奶、乳制品种的传统糖分。有研究表明，在婴幼儿奶粉中添加2％乳果糖即可达到母乳喂养的效果。乳果糖还具有良好的保湿性，可防止糕点由于表面风干硬化影响其口感。还可以作为风味增强剂，在巧克力的生产中产生有利的褐变行为。
[0006](Ⅲ)乳果糖在饲料中的应用。2011年，乳果糖被欧盟饲料和食品质量安全管理局(Quality and Safety of Feeds and Food for Europe；European Commission 2011)认定为一种新型饲料添加剂。它可以通过促进双歧杆菌和乳酸杆菌增殖，抑制沙门氏菌的生长，提高畜禽对肠道疾病的免疫力，从而减少抗生素在饲料中的使用。研究证明，向肉鸡食用的饲料中添加适量的乳果糖，肉鸡净增量、存活率都有一定的增加。
[0007]目前，商业化的乳果糖主要是由化学法合成。这一过程需要大量的化学催化剂，并产生大量副产物，涉及复杂的分离和纯化步骤。相对而言，酶法催化乳糖生成乳果糖条件比较温和，可以克服化学法生产乳果糖的一些缺点，适合低碳经济和绿色环保的要求。
[0008]目前用于催化乳糖生成乳果糖的酶主要有糖苷水解酶(glycosidehydrolase,EC3.2.1)和纤维二糖差向异构酶(Cellobiose 2
‑
Epimerase,CE,EC5.1.3.11)。而在这其中，纤维二糖差向异构酶(CEs)能够直接催化单一乳糖生产乳果糖，是目前最高效的乳果糖
制备用酶，因而受到了广泛的关注。但是目前的纤维二糖异构酶酶活较低、乳果糖转化率不高，阻碍了纤维二糖异构酶的工业化生产。

技术实现思路

[0009]针对目前存在的纤维二糖异构酶酶活较低、乳果糖转化率不高的问题，本专利技术通过对来源于嗜热链球菌Dictyoglomusthermophilum的纤维二糖差向异构酶(DtCE)进行改造，以获得酶活及乳果糖转化率提高的突变体，将突变体应用于乳果糖的生产，以提高乳果糖的产量。
[0010]本专利技术提供了纤维二糖差向异构酶突变体，以DtCE为亲本酶，将亲本酶第67位，或第143位，或第175位，或第180位，或第282位，或第284位，或第303位进行突变；亲本酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，编码亲本酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本酶第67位氨基酸突变为N或E。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本酶第143位氨基酸突变为F或I。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本酶第175位氨基酸突变为S或I。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本酶第180位氨基酸突变为K或D。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本酶第282位氨基酸突变为G或A或I。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本酶第284位氨基酸突变为G或A。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本酶第303位氨基酸突变为E或R或V。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为将亲本酶第67位氨基酸突变为N、第180位氨基酸突变为K、第282位氨基酸突变为G、第303位氨基酸突变为E。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为将亲本酶第67位氨基酸突变为N、第180位氨基酸突变为D、第282位氨基酸突变为I、第303位氨基酸突变为V。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为将亲本酶第180位氨基酸突变为K、第282位氨基酸突变为I、第303位氨基酸突变为V。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本酶第67位氨基酸突变为E、第180位氨基酸突变为K、第282位氨基酸突变为I。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为将亲本酶第67位氨基酸突变为E、第180位氨基酸突变为D、第282位氨基酸突变为A、第303位氨基酸突变为R。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为将亲本酶第67位氨基酸突变为E、第180位氨基酸突变为K、第282位氨基酸突变为I、第303位氨基酸突变为V。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本酶第143位氨基酸突变为I、第175位氨基酸突变为S、第284位氨基酸突变为A。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本酶第143位氨基酸突变为I、第175位氨基酸突变为S、第284位氨基酸突变为G。
[0027]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本酶第143位氨基酸突变为F、第175位氨基酸突变为S、第284位氨基酸突变为A。
[0028]在本专利技术的一种实施方式中，将亲本酶第143位氨基酸突变为F、第175位氨基酸突
变为S、第284位氨基酸突变为G。
[0029]在本专利技术的一种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.纤维二糖差向异构酶突变体，其特征在于，以SEQ ID NO.1为亲本酶，对亲本酶的第67位，或第143位，或175位，或第180位，或第282位，或第284位，或第303位中的一个或多个氨基酸突变。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，将亲本酶第67位氨基酸突变为天冬酰胺或谷氨酸；将亲本酶第143位氨基酸突变为苯丙氨酸或异亮氨酸；将亲本酶第175位氨基酸突变为丝氨酸或异亮氨酸；将亲本酶第180位氨基酸突变为赖氨酸或天冬氨酸；将亲本酶第282位氨基酸突变为甘氨酸或丙氨酸或异亮氨酸；将亲本酶第284位氨基酸突变为甘氨酸或丙氨酸；将亲本酶第303位氨基酸突变为谷氨酸或精氨酸或缬氨酸。3.编码权利要求1或2所述突变的基因。4.携带权利要求3所述基因的重组表达载体。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，刘展志，张颖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：