一种亚油酸异构酶及其在共轭亚油酸生产中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种亚油酸异构酶及其在共轭亚油酸生产中的应用，属于蛋白质工程和微生物工程技术领域。本发明专利技术的来源于双岐杆菌的亚油酸异构酶可用于生产共轭亚油酸，将含有本发明专利技术亚油酸异构酶的重组大肠杆菌加入含亚油酸的反应体系中反应3h，即可使共轭亚油酸的转化率高达12.1～42.1％，且可使共轭亚油酸中cis9,trans11

【技术实现步骤摘要】
一种亚油酸异构酶及其在共轭亚油酸生产中的应用


[0001]本专利技术涉及一种亚油酸异构酶及其在共轭亚油酸生产中的应用，属于蛋白质工程和微生物工程


技术介绍

[0002]共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是一系列含有共轭双键、具有多种位置和几何异构体的脂肪酸的总称。研究表明，共轭亚油酸具有抗癌、降脂、抗动脉粥状硬化、调节能量代谢、增强机体免疫力与促进生长发育等生理作用，被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域，而cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA是共轭亚油酸异构体中最具有生理活性的两种异构体。因此，市场上对cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA的需求极大。
[0003]天然的共轭亚油酸主要存在于瘤胃动物、某些植物和海洋生物中，并且，这些天然的共轭亚油酸主要以cis9,trans11-CLA的形式存在，生理活性极高，但是，它们含量极少，难以满足市场对于共轭亚油酸的需求。因此，人们逐渐开发了人工合成共轭亚油酸的方法。
[0004]目前，人工合成共轭亚油酸的方法主要有化学合成法以及微生物合成法。其中，化学合成法会导致很多有毒性的副产物的产生，对环境以及人体均具有毒害作用，并且，通过化学合成法制备得到的共轭亚油酸异构体种类多，很难进行有效的分离，因此，化学合成法无法真正实现共轭亚油酸的大规模工业化生产。与化学合成法相比，微生物合成法具有污染少、所得共轭亚油酸异构体种类单一的优点，因此，微生物合成法是一种极具潜力的可实现共轭亚油酸大规模工业化生产的方法。
[0005]不过，现有的微生物合成法仍存在以下缺陷：
[0006]第一，大部分可高产共轭亚油酸的微生物均为致病菌，存在极大的安全性问题，不能直接作为共轭亚油酸生产菌株进行工业化生产，例如，溶纤维丁酸弧菌、丙酸杆菌以及产芽孢梭状芽孢杆菌等；
[0007]第二，部分可高产共轭亚油酸的微生物生产共轭亚油酸产量不高，若作为共轭亚油酸生产菌株进行工业化生产，生产效率过低，例如，植物乳杆菌ZS2058(具体可见参考文献：齐慧,杨波等.植物乳杆菌ZS2058生物转化共轭亚油酸机理的研究[D],江南大学,2017)，
[0008]上述缺陷均使得现有的微生物合成法无法真正实现共轭亚油酸的大规模工业化生产，因此，急需找到一种安全性高且产量高的共轭亚油酸生产菌株以克服上述缺陷。

技术实现思路

[0009][技术问题][0010]本专利技术要解决的技术问题是提供一种可用于生产共轭亚油酸的亚油酸异构酶。
[0011][技术方案][0012]为解决上述问题，本专利技术提供了一种亚油酸异构酶(Linoleic acid isomerase,
EC 5.2.1.5)，其特征在于，所述亚油酸异构酶为：
[0013](a)由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，
[0014](b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有亚油酸异构酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的亚油酸异构酶来源于短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)，所述由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的亚油酸异构酶来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，所述由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的亚油酸异构酶来源于假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)，所述由SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的亚油酸异构酶来源于齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)。
[0016]本专利技术还提供了一种基因，所述基因编码上述亚油酸异构酶。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示。
[0018]本专利技术还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET-28a(+)载体。
[0020]本专利技术还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0022]本专利技术还提供了上述亚油酸异构酶或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在生产共轭亚油酸方面的应用。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述共轭亚油酸为cis9,trans11-CLA和/或trans9,trans11-CLA。
[0024]本专利技术还提供了一种生产共轭亚油酸的方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至培养基中，于温度为35～40℃、转速为150～250rpm的条件下培养至OD
600
为0.4～0.6，得到培养液A；在培养液A中加入终浓度为0.01～1.0mM的IPTG，于温度为15～20℃、转速为150～250rpm的条件下诱导培养12～16h，得到培养液B；将培养液B离心，收集湿菌体；以亚油酸为底物，在含亚油酸的反应体系中加入湿菌体，于温度为35～40℃、转速为150～250rpm的条件下进行反应，得到富含共轭亚油酸的反应液；将富含共轭亚油酸的反应液进行提取，得到共轭亚油酸。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为将上述宿主细胞接种至培养基中，于温度为37℃、转速为200rpm的条件下培养至OD
600
为0.4～0.6，得到培养液A；在培养液A中加入终浓度为0.01～1.0mM的IPTG，于温度为18℃、转速为200rpm的条件下诱导培养12～16h，得到培养液B；将培养液B离心，收集湿菌体；以亚油酸为底物，在含亚油酸的反应体系中加入湿菌体，于温度为37℃、转速为200rpm的条件下进行反应，得到富含共轭亚油酸的反应液；将富含共轭亚油酸的反应液进行提取，得到共轭亚油酸。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，所述共轭亚油酸为cis9,trans11-CLA和/或trans9,trans11-CLA。
[0027]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应体系包含缓冲液以及亚油酸。
[0028]在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液的pH为6～7。
[0029]在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液的pH为6.5。
[0030]在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液为磷酸钾缓冲液。
[0031]在本专利技术的一种实施方式中，所述亚油酸在反应体系中的浓度为0.05～0.15mg/mL。
[0032]在本专利技术的一种实施方式中，所述亚油酸在反应体系中的浓度为0.1mg/mL。
[0033]在本专利技术的一种实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亚油酸异构酶，其特征在于，所述亚油酸异构酶为：(a)由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有亚油酸异构酶活性的由(a)衍生的蛋白质。2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的亚油酸异构酶。3.如权利要求2所述的一种基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示。4.一种重组质粒，特征在于，所述重组质粒携带权利要求2或3所述的基因。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的重组质粒。6.如权利要求5所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。7.权利要求1所述亚油酸异构酶或权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组质粒或权利要求5或6所述宿主细胞在生产共轭亚油酸方面的应用。8.一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述方法为将权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海琴，杨波，高鹤，赵建新，陈永泉，张灏，陈卫，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：