本发明专利技术提供一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，利用同轴式生物3D打印，以氯化钙溶液作为内层，将甲基丙烯酸酐化明胶，海藻酸钠，聚乙二醇二丙烯酸酯及血管平滑肌细胞混合作为外层生物墨水，打印出的支架通过氯化钙和蓝外光照进行彻底交联，最后形成三位一体化可灌流支架，从而建立血运。在支架内灌注血管内皮细胞，模拟血管细胞成分。在三层支架上分别接种成纤维细胞，脂肪间充质干细胞，骨骼肌成肌细胞，分别加入成纤维细胞培养基，成脂诱导培养基及成肌细胞培养基并放置于反应器中进行培养，将三层支架进行折叠，通过鼠尾胶原进行粘接，形成堆叠式支架。本发明专利技术实现了血流的一体化灌注，不同细胞成分的独立培养分化以及组装。养分化以及组装。养分化以及组装。
【技术实现步骤摘要】
一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法
[0001]本专利技术涉及生物材料
，具体是一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法。
技术介绍
[0002]肌皮瓣是一种复合组织瓣，是利用身体某块肌肉(或一部分肌肉)连同其浅层的皮下组织、皮肤一并切取，以进入该肌肉的血管为蒂进行转移，用于较大创面缺损的修复或肌肉功能的重建。肌皮瓣的血液供应充沛，抗感染力强，易于成活，组织量丰富，是整形重建外科常用的组织瓣之一。
[0003]现有技术包括3D打印，模具成型等，但存在难以实现不同细胞成分的独立培养分化，难以实现血流的一体化灌注以及不同细胞组分的组装。
技术实现思路
[0004]针对上述现有技术的不足，本专利技术提供一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，具体包括如下步骤：
[0005](1)以氯化钙溶液作为内层，将甲基丙烯酸酐化明胶，海藻酸钠，聚乙二醇二丙烯酸酯及血管平滑肌细胞混合作为外层生物墨水，设计串联的三个支架，利用生物3D打印机进行同轴打印；
[0006](2)将步骤(1)打印出的支架通过氯化钙和蓝光光照进行彻底交联，最后形成三位一体化可灌流支架，从而建立血运，在支架内灌注血管内皮细胞，模拟血管细胞成分；
[0007](3)在三个支架上分别接种成纤维细胞，脂肪间充质干细胞，骨骼肌成肌细胞，并放置于生物反应器的反应仓中进行分隔独立培养及一体化灌注；
[0008](4)向步骤(3)中三个反应仓中分别加入成纤维细胞培养基，成脂诱导培养基及成肌细胞培养基培养7
‑
14天，将三层支架进行折叠，通过鼠尾胶原进行粘接，形成堆叠式支架，继续培养7
‑
21天，以促进三层融合，得到立体血管化肌皮瓣。
[0009]进一步的，所述步骤(1)中外层生物墨水的制备步骤如下：按照质量体积比将5％
‑
8％甲基丙烯酰化明胶，1
‑
3％海藻酸钠，10
‑
15％聚乙二醇二丙烯酸酯和0.05
‑
0.1％光引发剂LAP溶解在4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，再加入血管平滑肌细胞，使细胞浓度为5*106‑
107个/mL。
[0010]进一步的，所述外层生物墨水制备好后储存在37℃直到使用。
[0011]进一步的，所述步骤(1)中CaCl2溶液的浓度为25
‑
75mM，采用双通道同轴系统打印三维管状结构，内层为CaCl2溶液，使用20mL注射器，挤出速度为0.1mm
‑
0.2/min，外层为生物墨水，使用5mL注射器，挤出速度为0.56
‑
1.12mm/min。
[0012]进一步的，步骤(1)打印出的支架首先以CaCl2溶液交联，然后暴露在蓝光下5
‑
10min进一步交联。
[0013]进一步的，所述步骤(2)中在支架内灌注血管内皮细胞的具体步骤如下：通过留置
针连接步骤(2)中所述的支架，向支架内通入0.5
‑
1mL血管内皮细胞悬液，关闭留置针，将支架连接留置针静置于生物反应仓平板上，扣上生物反应仓上半部分，通过螺丝固定上下部分反应仓，调整螺丝松紧度，固定支架，放于5％CO2培养箱中，待1.5
‑
2h后将留置针打开连接橡胶管及培养瓶，培养瓶内装入F12K培养基，将橡胶管连接蠕动泵，设置灌注速度为200
‑
300uL/min，然后运行蠕动泵进行动态灌注培养3
‑
5天。
[0014]进一步的，所述步骤(3)的具体操作如下：在支架的第一层管网结构上滴加0.5
‑
1mL成纤维细胞悬液，在第二层管网结构上滴加0.5
‑
1mL脂肪干细胞悬液，在第三层管网结构上滴加0.5
‑
1mL骨骼肌成肌细胞悬液，再将打印的支架连接生物反应器，三个反应仓分别加入低糖完全培养基进行培养。
[0015]进一步的，经过低糖完全培养基培养3
‑
5天后，第二个反应仓中更换为成脂诱导培养液，第三个反应仓内更换为骨骼肌诱导分化培养液，培养7
‑
10天后将支架进行折叠拼装，三个组分间利用鼠尾胶原进行粘连固定，继续动态培养7
‑
10天。
[0016]进一步的，所述成纤维细胞、脂肪间充质干细胞、骨骼肌成肌细胞的细胞悬液采用的是低糖完全培养基进行配制，血管内皮细胞悬液采用的是RPMI完全培养基进行配制，其中细胞的含量为5*106‑
107个/mL。
[0017]一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣，由以上制备方法制备得到的。
[0018]本专利技术的有益效果：自体皮瓣来源有限，存在取材部位创伤较大的缺点，本专利技术可以克服以上不足。对比现有的肌皮瓣制作方法，本专利技术具有材料生物相容性高；可模拟正常肌皮瓣结构层次；细胞组分更加仿生；生物反应器可以实现不同细胞的独立培养及分化；存在一体化的血管通道，可以连接自体血管进行灌注，从而提高细胞的存活率。
附图说明
[0019]图1是本专利技术的实验流程图；
[0020]图2是本专利技术制作的支架可灌注性检测实验照片；
[0021]图3是本专利技术制作的支架的折叠后的照片；
[0022]图4是本专利技术支架的表征图片；
[0023]图5是三个支架厚度各异的复合支架图片；
[0024]图6是血管平滑肌细胞在支架内的染色显示图；
[0025]图7是FDA/PI活死细胞染色图；
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。
[0027]以下实施例中光引发剂LAP为苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基膦酸锂，F12K完全培养基为F12K+1％青链霉素+10％胎牛血清，成纤维细胞、脂肪干细胞、骨骼肌成肌细胞的细胞悬液采用的是低糖完全培养基(low
‑
glucose DMEM+1％青链霉素+10％胎牛血清FBS)进行配制。
[0028]血管内皮细胞悬液采用的是RPMI完全培养基(RPMI+1％青链霉素+10％胎牛血清)进行配制。
[0029]实施例1
[0030]一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，具体步骤如下：(1)按照质量体积比5％GelMA(甲基丙烯酰化明胶)，2％海藻酸钠，10％PEGDA(聚乙二醇二丙烯酸酯)和0.05％LAP溶解在25mM的4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(HEPES)中。加入血管平滑肌细胞，使细胞浓度为10^7个/mL。墨水储存在37摄氏度直到使用。配制50mM CaCl2溶液作为离子交联剂。采用双通道同轴系统打印三维管状结构。内层为50mM CaCl2溶液，使用20mL注射器，挤出速度为0.1mm/min。外层为生物墨水，使用5mL注射器，挤本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其特征在于包括如下步骤：(1)以氯化钙溶液作为内层，将甲基丙烯酸酐化明胶，海藻酸钠，聚乙二醇二丙烯酸酯及血管平滑肌细胞混合作为外层生物墨水，设计串联的三个支架，利用生物3D打印机进行同轴打印；(2)将步骤(1)打印出的支架通过氯化钙和蓝光光照进行彻底交联，最后形成三位一体化可灌流支架，从而建立血运，在支架内灌注血管内皮细胞，模拟血管细胞成分；(3)在三个支架上分别接种成纤维细胞，脂肪间充质干细胞，骨骼肌成肌细胞，并放置于生物反应器的反应仓中进行分隔独立培养及一体化灌注；(4)向步骤(3)中三个反应仓中分别加入成纤维细胞培养基，成脂诱导培养基及成肌细胞培养基培养7
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14天，将三层支架进行折叠，通过鼠尾胶原进行粘接，形成堆叠式支架，继续培养7
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21天，以促进三层融合，得到立体血管化肌皮瓣。2.根据权利要求1所述的基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其特征在于：所述步骤(1)中外层生物墨水的制备步骤如下：按照质量体积比将5％
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8％甲基丙烯酰化明胶，1
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3％海藻酸钠，10
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15％聚乙二醇二丙烯酸酯和0.05
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0.1％光引发剂LAP溶解在4
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羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，再加入血管平滑肌细胞，使细胞浓度为5*106‑
107个/mL。3.根据权利要求2所述的基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其特征在于：所述外层生物墨水制备好后储存在37℃直到使用。4.根据权利要求1所述的基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其特征在于：所述步骤(1)中CaCl2溶液的浓度为25
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75mM，采用双通道同轴系统打印三维管状结构，内层为CaCl2溶液，使用20mL注射器，挤出速度为0.1mm
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0.2/min，外层为生物墨水，使用5mL注射器，挤出速度为0.56
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1.12mm/min。5.根据权利要求1所述的基于生物3D打印的立体血管化肌皮瓣的制作方法，其特征在于：步骤(1)打印出的支架首先以CaCl2溶液交联，然后暴露在蓝光下...
【专利技术属性】
技术研发人员：牟珊，汪振星，孙家明，周莹芊，郭亚琪，锁丽涛，陈雳风，周牧冉，刘绍恺，罗超，曾宇阳，方慧敏，慈海，侯金飞，谢昕芳，孙谛，张郭，刘剑，王冰倩，倪若飘，王斌，陈佳龙，李志鹏，姜文彬，揭君津，赵阳，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
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